生物化學研究技術--3SDS-PAGE鑒定菠蘿蛋白酶的純度ppt課件

1、SDS-PAGE鑒定菠蘿蛋白酶的純度鑒定菠蘿蛋白酶的純度一、實驗目的一、實驗目的1、學習和掌握電泳SDS-PAGE的基本原理及電泳技術。2、熟練配制SDS-PAGE相關各種試劑。二、實驗原理二、實驗原理 電泳電泳: :帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動，這種現象稱為電泳。荷的電極移動，這種現象稱為電泳。影響電泳的主要因素影響電泳的主要因素 （1顆粒性質：一般說來，顆粒帶凈電荷量越大，或其直徑越小，或其形狀越接近球形，在電場中的泳動速度就快。反之，則越慢。（2電場強度：電場強度越高，帶電顆粒的泳動速度越快。反之，則越慢。（3pH值（4離子強度：溶液的

2、離子強度一般在0.020.2mol/kg之間電泳較合適。（5溶液粘度（6電滲（7焦耳熱（8篩孔 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的一種電泳。支持物的一種電泳。 這種凝膠是由丙烯酰胺單體這種凝膠是由丙烯酰胺單體( (簡稱簡稱 Acr) Acr)和交聯和交聯劑劑 N N，N N- -甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺( (簡稱簡稱Bis)Bis)，在催化，在催化劑的作用下聚合而成的。劑的作用下聚合而成的。 聚丙烯酰胺凝膠聚合的體系有兩種，即化學聚合聚丙烯酰胺凝膠聚合的體系有兩種，即化學聚合和光聚合。和光聚合。 化學聚合的引發劑是過硫酸銨化學聚合的引發

3、劑是過硫酸銨(NH4)2S2O3(NH4)2S2O3(簡簡稱稱Ap)Ap)，催化劑是，催化劑是N N，N N，N N，N N- -四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)。在催化劑。在催化劑TEMEDTEMED的作用下，由過硫酸銨的作用下，由過硫酸銨(Ap)(Ap)形成氧的自由基，后者又使單體形成自由基，形成氧的自由基，后者又使單體形成自由基，從而引起聚合作用。從而引起聚合作用。 聚丙烯酰胺凝膠的質量主要由凝膠濃度和交聯度決定。聚丙烯酰胺凝膠的質量主要由凝膠濃度和交聯度決定。 每每100mL凝膠溶液中含有的單體凝膠溶液中含有的單體(Acr)和交聯劑和交聯劑(Bis)總總克數稱為凝膠

4、濃度，用克數稱為凝膠濃度，用T表示。表示。 凝膠溶液中，交聯劑凝膠溶液中，交聯劑(Bis)占單體占單體(Acr)和交聯劑和交聯劑(Bis)總總量的百分數稱為交聯度，用量的百分數稱為交聯度，用C表示。表示。 不連續的聚丙烯酰胺凝膠電泳，帶電顆粒在電不連續的聚丙烯酰胺凝膠電泳，帶電顆粒在電場中的泳動有電荷效應、分子篩效應還具有濃場中的泳動有電荷效應、分子篩效應還具有濃縮效應。縮效應。 (l) (l) 濃縮效應濃縮效應 (2)(2)電荷效應電荷效應 (3)(3)分子篩效應分子篩效應Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200實驗試劑配制實驗試劑配制 30%

5、凝膠貯液：取凝膠貯液：取30g丙烯酰胺丙烯酰胺Acr）、）、0.8g甲叉雙甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺(Bis), （先用約（先用約50ml蒸餾水溶解，如溶解不蒸餾水溶解，如溶解不了了,可加熱可加熱3050溶解溶解,再用量筒定容至再用量筒定容至100ml，然后，然后過濾，后置于棕色瓶過濾，后置于棕色瓶,4下保存備用）。下保存備用）。聚丙烯酰胺具有神經毒性，操作時要戴手套聚丙烯酰胺具有神經毒性，操作時要戴手套(2) 10%過硫酸銨過硫酸銨(AP)溶液：取溶液：取2g過硫酸銨溶解后，過硫酸銨溶解后，用用20ml dH2O溶解，現配現用。溶解，現配現用。(3) 1 mol/L HCl 500ml：取濃：取

6、濃HCl 42 ml，加蒸餾水至，加蒸餾水至500 ml(在通風櫥中操作在通風櫥中操作)。(4) 分離膠緩沖溶液分離膠緩沖溶液1.5mol/L Tris-HCl緩沖液，緩沖液，pH8.8）:取取18.15g Tris溶解后，加溶解后，加1mol/L HCl溶液約溶液約48ml，調，調pH至至8.8, 定容至定容至100ml。(5) 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl緩沖液緩沖液,pH6.8): 取取6g Tris溶解后，加溶解后，加1mol/L HCl溶液溶液40ml，調，調pH至至6.8，定，定容至容至100ml 。(6) 10%SDS(十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉

7、)溶液溶液: 取取5g SDS加水定容至加水定容至50ml。（加熱溶解）。（加熱溶解）(7) 2電極緩沖液電極緩沖液(0.1%SDS0.05mol/L Tris0.384mol/L甘氨酸緩沖液，甘氨酸緩沖液，pH8.3):取取6gTris，28.8g甘氨酸和甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容至加水溶解后，定容至000ml配好的溶液配好的溶液pH8.3）(12個組可配個組可配2升升,使用時再稀釋使用時再稀釋2倍倍)。 (8) 樣品溶解液：取樣品溶解液：取SDS g，-巰基乙醇巰基乙醇 ml，甘油，甘油10ml，溴酚藍，溴酚藍0.1g，0.5mol/L pH6.8 TrisHCl緩沖液緩沖液 (

8、濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液)10ml，加蒸餾水，加蒸餾水25ml，(最后的總體積最后的總體積為為50 ml),裝于棕色瓶。裝于棕色瓶。(9)染色液染色液0.1%考馬斯亮藍考馬斯亮藍-45%甲醇甲醇-10%冰乙酸溶冰乙酸溶液）：液）：1g考馬斯亮藍考馬斯亮藍R250，加入，加入450 ml 甲醇、甲醇、100ml冰乙酸，用水定容至冰乙酸，用水定容至1000 ml。(12個組可配個組可配2000 ml)(10)脫色液脫色液高甲醇高甲醇1000ml：甲醇：甲醇 454ml，冰醋酸，冰醋酸75ml，dH2O 471 ml低甲醇低甲醇1000ml ：甲醇：甲醇 50ml，冰醋酸，冰醋酸75ml，dH2O

9、875 ml七實驗步驟七實驗步驟1.1.清洗并吹干玻璃板。清洗并吹干玻璃板。2.2.在塑料膠條的兩面涂少量凡士林注意不能涂多，以在塑料膠條的兩面涂少量凡士林注意不能涂多，以防弄臟玻璃板）。防弄臟玻璃板）。3.3.把玻璃板放入電泳槽中。把玻璃板放入電泳槽中。4.4.用小燒杯加用小燒杯加6ml6ml蒸餾水，蒸餾水，2ml 30%2ml 30%凝膠儲液，凝膠儲液，20 ul 20 ul TEMEDTEMED，100ul 10100ul 10過硫酸銨，混勻，迅速倒入封口槽過硫酸銨，混勻，迅速倒入封口槽處處( (一定要快！一定要快！) )，靜置約，靜置約10min10min直到凝固。直到凝固。聚丙烯酰胺

10、具有神經毒性，操作時要戴手套聚丙烯酰胺具有神經毒性，操作時要戴手套5.5.加加dH2OdH2O于兩層玻璃之間，檢查玻璃底是否漏水；如果于兩層玻璃之間，檢查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重裝。漏水，要重裝。6.按下表用小燒杯配12%分離膠，混勻，灌膠，高度離梳子約11.5cm，然后覆蓋一層水，凝膠時間為1530min，膠與水分層，傾倒去水。12%分離膠5%濃縮膠 30%凝膠貯液4000l810 l上層膠緩沖液pH6.81250 l下層膠緩沖液pH8.82500lTEMED（四甲基乙二胺)30 l20 l10%SDS100l50ldH2O3270l2820lAP（過硫酸氨）100l50 l7.凝好膠

11、，垂直拔掉梳子不要左右搖梳子）。8.上槽加入電泳緩沖液電極緩沖液稀釋2倍），液面需沒過低玻璃板；下槽電泳緩沖液沒過玻璃板封膠處1cm。9.用1.5ml ep管取100l粗酶樣品與100l樣品溶解液混合均勻，與蛋白質分子量標準一起置于沸水浴5min）。10.微量注射器按下表2點樣，隔孔點樣，注意不要交叉污染每點一個樣都要清洗微量注射器）。表2 點樣方式孔1234567891011加樣粗酶標準蛋白過柱1過柱2過柱3體積L304030353535 *微量注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高, 樣品下沉時易發生擴散，溢出加樣孔11.上槽接負極，下槽接正極。12.恒電流電泳：濃縮膠，1012 mA，

12、待溴酚藍遷移到濃縮膠與分離膠的界面調整電流至20mA。13.待溴酚藍遷移到距分離膠底部0.51cm處，結束電泳。14.染色2030min），回收染色液。15.脫色：高甲醇6080ml，25min；高甲醇4060ml 20min；低甲醇80100ml完全脫凈剝膠時要小心剝膠時要小心, ,保持膠完好無損保持膠完好無損, ,染色要充分染色要充分16.拍照并畫電泳圖譜，計算標準蛋白、待測樣品的相對遷移率蛋白相對遷移率蛋白遷移距離/指示劑遷移距離）。17.用低分子量標準蛋白質所作的標準曲線，求待測樣品亞基的相對分子量。18.以標準蛋白質電泳的相對遷移率為橫坐標(X)，標準蛋白質分子量的對數為縱坐標(Y)

13、，繪標準蛋白質的標準曲線，再根據樣品相對遷移率在曲線上求出其蛋白質的分子量。蛋白名稱 遷移距離 相對遷移率（Y） 蛋白分子量(D) 蛋白分子量對數(X) 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 牛碳酸酐酶 牛蛋白酶抑制劑 雞蛋清溶菌酶 過柱的菠蘿蛋白酶 指示劑 -低分子量標準蛋白質的組分：低分子量標準蛋白質的組分：1) 1) 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B 分子量分子量 97,400 97,4002) 2) 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 分子量分子量66,20066,2003) 3) 兔肌動蛋白兔肌動蛋白 分子量分子量43,00043,0004) 4) 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 分子量分子量31,00031,0005) 5) 牛蛋白酶抑制劑牛蛋白酶抑制劑 分子量分子量20,10020,1006) 6) 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 分子量分子量14,40014,400八實驗注意事項八實驗注意事項1.緩沖液的緩沖液的pH值、濃度要準確配置；值、濃度要準確配置；2.AP新鮮配置。新鮮配置。3.SDS在低溫下析出，使用前水浴在低溫下析出，使用前水浴加熱使之溶解。加熱使之溶解。九實驗結果