尿路上皮癌相關8種基因檢測試劑盒（PCR熒光探針法）（CSZ2300427）

產品中文名稱：尿路上皮癌相關8種基因檢測試劑 3 3 3 3 4 4 6 10 11 14杭州可幫基因科技有限公司浙江省杭州市臨平區余杭經濟技術開發區新顏路22號7幢301M杭州市臨平區龍船塢路157號3幢5層502室；杭州市臨平區龍船塢路157號5幢3層1309、1310室一、產品概述（一）產品主要組成成分產品主要組成成分見表1：表1試劑盒主要組成成分123DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸4567具體內容詳見產品說明書。（二）產品預期用途本產品用于體外定性檢測人尿液脫落細胞樣本中編碼RNACA9、CCL18、ERBB2、IGF2、MMP12、PPP1R14D、SGK2和非編碼RNASWINGN共8種尿路上皮癌相關基因的表達水平。本產品用于疑似尿路上皮癌初診患者的輔助診斷。本產品采用熒光PCR方法對上述8個基因的表達水平進行檢測，適用于有血尿、膀胱刺激癥等臨床癥狀，或經影像學等非侵入性方法顯示異常，臨床可能需進一步檢查的疑似尿路上皮癌初診患者的輔助診斷，尤其是經影像學等非侵入性方法無法決策病例是否進行鏡檢的輔助診斷，可為患者提供一種尿路上皮癌的無創輔助診斷選擇，但不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據。臨床醫生應結合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。（三）產品包裝規格24測試/盒。（四）產品檢驗原理本產品檢驗原理主要包括RNA提取、逆轉錄及熒光定量PCR三個步驟。通過核酸提取試劑提取尿液脫落細胞中的RNA進行逆轉錄反應產生cDNA。采用雙重PCR分別檢測8個尿路上皮癌相關靶基因，每個反應管分別檢測1個靶基因和人源管家基因（GAPDH）的表達水平，通過ΔCt值反映細胞中8個靶基因的表達水平。人源管家基因GAPDH作為內部參照（以下簡稱內參，InternalControl（IC））系統，對樣本RNA提取、逆轉錄和PCR反應過程進行質量控制，其Ct值參與計算。本產品利用特異性的引物對8個尿路上皮癌相關基因及內標基因GAPDH進行PCR擴增，并通過TaqMan探針對擴增產物進行檢測，在實時熒光PCR平臺上獲取樣本尿路上皮癌相關基因的表達Ct值。采用《尿路上皮癌基因分析軟件》對待測樣本的各基因表達Ct值進行分析，計算樣本的綜合評分，獲得分析結果。二、臨床前研究概述（一）主要原材料1.主要原材料的選擇該產品的主要原材料包括引物、探針、dNTP、DNA聚合酶及對照品等。其中對照品為申請人自行生產，其他原材料均通過外購的方式獲得。申請人對主要原材料進行了供應商的選擇，通過功能性實驗篩選出合格供應商，制定了各主要原材料的技術要求和質量標準并經檢驗合格。2.企業參考品和對照品的設置情況該產品企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和重復性參考品，均由臨床樣本制備而成。陽性參考品：8份，來源于試劑盒涵蓋的不同臨床分期和病理分級的尿路上皮癌樣本。陰性參考品：5份，來源于試劑盒檢測范圍外的其他泌尿系統良惡性疾病樣本。檢測限參考品：2份，分別為產品檢出限參考品和基因表達檢出限參考品。重復性參考品：4份，包含弱陽性、強陽性濃度水平的產品重復性參考品和基因表達重復性參考品。基因表達檢出限參考品和重復性參考品均由臨床尿路上皮癌RNA樣本經逆轉錄得到cDNA后，采用數字PCR方法測定拷貝數后進行制備而成；其余參考品均由臨床樣本提取的RNA制備而成。該試劑盒同時設置了陽性對照和陰性對照，用于檢測過程中試劑和儀器的質量控制。此外，每個樣本均檢測內參基因，用于結果的判讀及評估樣本的質量。（二）生產工藝及反應體系研究申請人對試劑盒反應體系的研究包括引物探針濃度、PCR擴增預混液用量、逆轉錄酶和逆轉錄預混試劑用量的確定等；對反應條件的研究包括逆轉錄反應程序、PCR反應程序和基線的確定等；對樣本采集處理、樣本保存時間、樣本用量和核酸提取進行了研究。通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。申請人根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果，確定了最佳的生產工藝。（三）分析性能評估該產品分析性能評估內容包括準確度、分析特異性（交叉反應和干擾物質研究）、檢出限和精密度。1.準確度研究在準確度研究中，申請人收集了若干例經臨床確診為尿路上皮癌或泌尿系統其他良惡性疾病的臨床樣本，進行真實臨床樣本的陽性/陰性符合率的測試，以評估產品檢測的準確度。測試結果符合要求。2.分析特異性分析特異性研究采用三批次試劑盒進行了交叉反應和干擾物在交叉反應研究中，申請人對臨床確診為非尿路上皮癌的樣本，包括泌尿系統良性病變和其他泌尿系統惡性腫瘤；以及對靶基因的同源序列進行檢測，結果均顯示申報產品無交叉反應。在干擾物質研究中，申請人對18種與尿液相關的內源和外源性潛在干擾物質（血、葡萄糖、蛋白質、乙醇、氯化鈉、血紅蛋白、左氧氟沙星、布洛芬、維生素C、大腸桿菌、白色念球菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌、解脲脲原體、絲裂霉素、吡柔比星、吉西他濱、卡介苗）進行了不同濃度下的對比測試，分析干擾物質在高濃度條件下對樣本檢測結果的影響，結果表明產品特異性良好，均未產生非特異性反應。3.檢出限研究檢出限研究包括產品檢出限和基因表達檢出限研究。申請人采用多例樣本和多批試劑分別進行了建立和驗證研究，建立確定產品檢出限為RNA濃度不高于6.5ng/μL，基因表達檢出限為不高于40拷貝/μL；并使用三批次試劑盒進行驗證，均符合要求。4.精密度在精密度研究中，申請人采用三批次試劑盒對不同的臨床樣本進行連續檢測，統計其檢測結果，并對批內、批間、日內、日間、不同操作者以及實驗室間精密度等進行了評價。研究結果表明，各基因擴增Ct值的變異系數CV均不高于5%，檢測結果（綜合評分）的變異系數CV均不高于15%。對三批次試劑盒采用企業強陽性產品重復性參考品和弱陽性產品重復性參考品進行重復性檢測，每批試劑盒每份參考品重復檢測10次，檢測結果均一致。對三批次試劑盒采用企業強陽性基因表達重復性參考品和弱陽性基因表達重復性參考品進行重復性檢測，每批試劑盒每份參考品重復檢測10次，每個靶基因的Ct值變異系數CV均不高于5%。（四）陽性判斷值研究本研究分為陽性判斷值的建立和驗證兩部分。納入的陽性病例120例，包括膀胱尿路上皮癌、腎盂尿路上皮癌和輸尿管尿路上皮癌；陰性病例共納入192例，包括泌尿系統良性病變、泌尿系統其他腫瘤等，共計312例。本產品根據各基因檢測結果Ct值，使用《尿路上皮癌基因分析軟件》計算分析獲得樣本的綜合評分。采用ROC曲線分析對綜合評分進行分析，確定本產品的陽性判斷值：綜合評分50；然后再采用驗證集進行獨立樣本驗證，確認本試劑盒的陽性判斷值設置合理。（五）穩定性研究申請人對產品的貨架穩定性（實時穩定性）、運輸穩定性和使用穩定性（包括開瓶穩定性、凍融穩定性）及樣本穩定性進行貨架有效期穩定性：將三批次試劑盒置于規定儲存條件下保存，分別于不同時間點領取完整包裝的試劑盒，使用企業參考品對試劑盒的性能進行檢測，結果表明試劑盒產品有效期為12個此外，申請人對產品的運輸穩定性、使用穩定性和樣本穩定性分別進行了研究。結果顯示，產品的性能均滿足產品說明書的三、臨床評價概述申請人在復旦大學附屬腫瘤醫院、浙江省人民醫院、浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院3家臨床試驗機構進行臨床試驗，采用試驗體外診斷試劑與臨床參考標準進行比較研究，確認本產品的臨床性能。其中，尿路上皮癌和其他惡性腫瘤病例采用病理診斷確診，其他疾病根據相關診療指南進行綜合診斷確診。入組病例包括：有血尿、膀胱刺激癥等臨床癥狀的病例，或經影像學等非侵入性方法顯示異常，臨床需進一步檢查的疑似尿路上皮癌初診患者，以及經影像學等非侵入性方法無法決策是否進行鏡檢的病例。樣本類型為尿液。臨床試驗共納入臨床有效病例955例，其中尿路上皮癌病例338例（覆蓋尿路上皮癌的所有分期及病理分型），非尿路上皮癌的其他病例617例（包括其他易產生干擾的腫瘤及各種良性疾病病例）。試驗結果顯示：本產品臨床靈敏度為95.86%（95%CI：93.17%-97.52%），臨床特異度為94.49%（95%CI：92.40%-96.03%），總符合率為94.97%（95%CI：93.40%-96.19%）。上述結果顯示試驗體外診斷試劑具有較好的臨床靈敏度和特異度，滿足臨床使用需求。此外，采用試驗體外診斷試劑對41例尿路上皮癌患者手術前后的樣本進行監測，41例樣本術前檢測結果為陽性，其中39例術后檢測結果為陰性；2例術后檢測結果仍為陽性。結果表明尿路上皮癌患者手術切除后尿液中mRNA水平降低。綜上所述，臨床試驗結果顯示該產品臨床性能滿足技術審四、產品受益風險判定根據《YY/T0316-2016醫療器械風險管理對醫療器械的應用》及其內部質量管理體系規定執行風險管理相關活動，對該產品進行受益風險判定。（一）受益評估本產品采用熒光PCR方法對上述8個基因的表達水平進行檢測，適用于有血尿、膀胱刺激癥等臨床癥狀，或經影像學等非侵入性方法顯示異常，臨床可能需進一步檢查的疑似尿路上皮癌初診患者的輔助診斷，尤其是經影像學等非侵入性方法無法決策病例是否進行鏡檢的輔助診斷，可為患者提供一種尿路上皮癌的無創輔助診斷選擇，但不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據。臨床醫生應結合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。臨床應用的主要受益為：該產品為臨床上疑似尿路上皮癌患者提供了一種輔助診斷方法的選擇。依據現有的臨床試驗結果，其對尿路上皮癌的診斷性能與臨床參考標準相比，具有較好的一致性，可滿足臨床應用基本要求。（二）風險評估申請人對已知危險（源）進行風險評價，按照風險可接受準則判斷每個危險（源）的風險是否達到可接受水平，對合理可行降低的風險、不經過風險/收益分析既判定為不可接受的風險采取控制措施，并對具體措施進行實施驗證，同時重新對采取措施后的風險進行估計，確認其風險水平是否可接受。盡管目前認為該試劑盒的受益大于風險，但為保證用械安全，基于對主要剩余風險的防控，已在該試劑盒說明書中提示以下信1.預期用途本產品采用熒光PCR方法對上述8個基因的表達水平進行檢測，適用于有血尿、膀胱刺激癥等臨床癥狀，或經影像學等非侵入性方法顯示異常，臨床可能需進一步檢查的疑似尿路上皮癌初診患者的輔助診斷，尤其是經影像學等非侵入性方法無法決策病例是否進行鏡檢的輔助診斷，可為患者提供一種尿路上皮癌的無創輔助診斷選擇，但不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據。臨床醫生應結合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。2.警示及注意事項：該試劑盒說明書中明確了該試劑盒檢驗方法的局限性及使用中的注意事項。依據《醫療器械監督管理條例》（國務院令第739號）、《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監督管理總局令第48號）等相關醫療器械法規與配套規章，經對申請人提交的注冊申報材料進行系統評價，申報產品符合安全性、有效性的要求，符合現有認知水平，建議準予注冊。通用名稱：尿路上皮癌相關8種基因檢測試劑盒（PCR熒本產品采用熒光PCR方法對上述8個基因的表達水平進行檢測，適用癥等臨床癥狀，或經影像學等非侵入性方法顯示異常，臨床可能需進皮癌初診患者的輔助診斷，尤其是經影像學等非侵入性方法無法決策病助診斷，可為患者提供一種尿路上皮癌的無創輔助診斷選擇，但不能診的依據。臨床醫生應結合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素尿路上皮癌的診斷主要依靠尿脫落細胞學檢查和膀胱鏡/輸尿管鏡檢查等是診斷尿路上皮癌最可靠的方法，但是內鏡檢查是侵入性檢查，不僅適，還可能造成感染和創傷[2,3]。隨著測序和芯片技術的發展，研究表明，液中的高頻率以及基因表達譜的信息性，通過尿液樣本進行RNA表達譜檢測可癌的檢測[4]。通過核酸提取試劑提取尿液脫落細胞中的RNA進行逆轉錄反采用雙重PCR分別檢測8個尿路上皮癌相關靶基因，每個反應管分別檢測1個靶源管家基因（GAPDH）的表達水平，通過ΔCt值反映細胞中8個靶基因的表達水平。人源基因GAPDH作為內部參照（以下簡稱內參，InternalControl（IC系統，對樣本RNA提取、逆轉錄和PCR反應過程進行質量控制并通過TaqMan探針對擴增產物進行檢測，在實時熒光PCR圖1檢測流程圖表1試劑盒組成及組分表編號1劑2液3Mg2+4條567探針引物預混條采用8聯PCR管設計，每一個8聯PCR管可檢測1份樣本，8聯PCR管上標1-8（8聯PCR管示意圖請見圖2）。8聯PCR管1-8號管內裝有相應的尿（Gene1~Gene8）和內參基因（GAPDH）檢測試劑（IC尿路上皮癌相關基因探編號檢測試劑熒光信號123456782）核酸提取或純化試劑：杭州可幫基因科技有限公司的尿液脫落細胞RNA提取試劑盒（吸3）分析軟件：杭州可幫基因科技有限公司的尿路上皮癌基因分析軟件，醫療器械注冊證書編微量紫外分光光度計、掌上離心機（帶適用于8聯PCR管的轉子）、移液器、4.運輸條件：本試劑盒可在-15℃~-25℃溫度下運輸；也可在泡沫箱加冰袋的條件下運輸，箱時溫度應不超過8℃,運輸時間不超過84小時。本試劑盒適用于西安天隆科技有限公司的全自動醫用PCR分析系統（Gentier96E）。2.樣本收集和保存：直接采用杭州可幫基因科技有限公司的樣本保存液（浙杭械備20201184號）進行尿液收集和保存。樣本保存液被預置分裝在材質為聚烯烴塑料的收集管中，規格為4mL/瓶。使用裝有樣本保存液的收集管直接3.使用杭州可幫基因科技有限公司的尿液脫落細胞RNA提取試劑盒（吸附柱法浙杭械備/3）取1μLRNA溶液，測定其濃度和純度。RNA濃度應≥6.5ng/μL且RNA吸注意：1）微量紫外分光光度計，其RNA吸收光譜的掃描波長范圍應涵蓋220nm-2）可根據計算公式計算RNA濃度或微量紫外分光光度計直接給出濃度所需檢測樣本數量按下表比例計算，并在無核酸酶的離心管/PCR管中配個待測樣本RNA上樣濃度應≥6.5ng/μL；每次檢測應），體積(μL）/管422.2將所有反應管充分混勻，≥5000rpm瞬時離心10秒，放入PCR儀或恒溫金屬浴中進行表3逆轉錄反應程序∞2.3逆轉錄反應完成后，反應產物cDNA溶液可用于后續PCR擴增，若不能立即進行擴增將cDNA溶液存放在2℃~8℃,保存時間不宜超過24小時；或者-15℃~-25℃保存，保存時間不3.1取離心管或PCR管，在管中加入：90μLPCR擴增預混液、20μL待測樣本的cDNA和33.2將探針引物預混條解凍，≥5000rpm轉速離心1分鐘，使得每個反應孔3.3使用移液器吸取步驟3.1中的混合液16μL，分別加入至探針引物預混條4.1將探針引物預混條放入熒光PCR儀；其中1號管朝上放置。對應PCR反應布局見表4。123…1…2…3…4…5…6…7…8…4.3選擇“樣本設置”，樣本類型設定為“待測”。選擇熒光信號“FAM”和“V“ROX”。本試劑盒內包含陽性對照品和陰性對照品作為質控，應在每批次檢測中添加，通過質控情況采用《尿路上皮癌基因分析軟件》進行分析，綜合評分應≥85，判讀結果為尿<30<36<27<31<33<36<36<38陰性對照品的內參基因的Ct值均應≤30；將檢測結果采用《尿路上皮癌5.4待測樣本的內參基因的Ct值應≤30，如果不符合，說明該樣本RNA可能存5.5待測樣本應至少有1個靶基因Ct值（FAM38，如果不符合，說明該樣本RNA未能提供6.2打開《尿路上皮癌基因分析軟件》（軟件版本：1.0）客戶端，上傳P6.3《尿路上皮癌基因分析軟件》自動分析PCR數據，獲得分析結果（見圖3尿路上皮癌基因本產品根據各基因檢測結果Ct值，使用《尿路上皮癌基因分析本產品共采用312例臨床尿液樣本（尿路上皮癌陽性樣本12），ROC曲線下面積─約登指數法，進行陽性判斷值的確定與驗證研究。陽性樣本包括皮癌、腎盂尿路上皮癌、輸尿管尿路上皮癌；陰性樣本包括泌尿系統良性病變、綜合評分≥50，判定為尿路上皮癌陽性；綜合評分＜50，判定為尿路圖3尿路上皮癌基因檢測結果圖2.不合理的樣本采集、轉運及處理，以及不當的實驗操作和實驗環境均有可能1)試劑盒應組分齊全，包裝外觀清潔、無泄漏、無破損；標識、標簽字跡清楚。試劑融化4)最低檢測限：檢測1份濃度3次，每個靶基因的Ct值均應＜38。5)精度密：通過檢測產品重復性參考品、基因表達重復性參考品和臨床樣本對本試劑盒的②檢測2份基因表達重復性參考品，各重復檢測10次③檢測臨床樣本，評價本試劑盒不同重復、批次、時間、儀器、操作者和地點間的精6)分析特異性：檢測非尿路上皮癌的其他泌尿系統惡性腫瘤臨床樣本，均未發生交叉反應；檢測泌尿系統良性疾病樣本，均未發生交叉反應；檢測相關靶基因的同源序列，均未發生交叉反應。檢測以下：血液（2%v/v）、葡萄糖（55mmol/L）、蛋白質（4g/L），左氧氟沙星（200mg/dL）、布洛芬（10mg/dL），維生素C（0.8mmol/L），白色念珠菌（1×109CFU/mL）、大腸桿菌（1×109CFU/mL）、金黃色葡萄球菌（1×109CFU/mL）、淋球菌（1×107CFU/mL）、解脲脲原體（5×106CFU/mL），絲裂霉素（200mg/L）、吡柔比星（170mg/L）、吉西他濱（6700mg/L）、卡介苗（400m