融合基因檢測的最終解決方案-Nanopore Direct RNA Sequencing解鎖融合基因檢測新范式 20250630

融合基因檢測的最終解決方案——NanoporeDirectRNASequencing解鎖融合基因檢測新范式一、引言在精準醫療的加速推動下，融合基因正成為連接基礎研究與臨床應用的橋梁。作為多種惡性腫瘤的關鍵驅動因素，融合基因不僅揭示著細胞命運被改寫的分子起點，也深刻影響著疾病的診斷分型、預后評估乃至靶向治療的選擇。越來越多的研究和指南表明，融合基因已從科學概念走向了臨床決策的中心。然而，識別它們，遠不如命名它們那么簡單。我們是否曾被令人困惑的檢測結果阻滯判斷？是否曾因一個結構不清、異構體不明的融合轉錄本而在功能研究中裹足不前？在現有檢測技術的邊界內，我們往往只能“猜測”融合，而無法“看清”融合。這正是當前融合基因檢測領域的最大困境——不是沒有數據，而是缺乏結構的真相。NanoporeDirectRNAsequencing（DRS），以其原始讀段跨越融合位點、捕獲完整轉錄本結構的能力，為融合基因的精準解析提供了前所未有的解決方案。它不僅讓融合“被看見”，更讓結構“可驗證”，是融合基因研究邁入“全景化”和“真實可讀”時代的重要起點。二、融合難見真容：傳統檢測手段的局限與盲區融合基因，作為兩段原本不相鄰的基因序列融合而成的產物，在癌癥的發生發展、診斷、治療指導和預后判斷中扮演著至關重要的角色。它們的出現往往伴隨著細胞功能的異常，可能驅動腫瘤生長，或賦予癌細胞對特定治療藥物的敏感性或耐藥性。因此，精準地檢測和解析融合基因，對于推動癌癥研究和實現個體化精準醫療具有舉足輕重的作用。然而，盡管融合基因的重要性不言而喻，但其檢測之路卻荊棘密布，現有的主流檢測技術在面對復雜多變的融合基因時，普遍暴露出諸多痛點與“盲區”：短讀長測序的拼接難題：信息碎片化帶來的高風險目前，以二代測序（NGS）為代表的短讀長測序技術是融合基因檢測的常用手段。但顧名思義，這些技術生成的序列片段通常較短。當融合位點恰好位于短讀長的末端或需要跨越較長的內含子區域時，就如同將一幅巨大的拼圖拆解成無數微小的碎片，難以準確地將融合位點兩側的序列拼接起來。這種信息碎片化極易導致：高假陽性風險：由于拼接算法的復雜性和序列重復區域的存在，可能出現“拼接錯誤”，將原本不融合的序列誤判為融合基因，從而誤導后續的臨床決策或研究方向。高假陰性風險：對于表達量較低的融合基因、含有復雜結構（如大片段插入或缺失）的融合轉錄本，或融合位點位于測序盲區的，短讀長測序可能因覆蓋不足或無法有效拼接而“漏檢”，使患者錯失潛在的靶向治療機會。無法捕獲完整轉錄本信息：“管中窺豹”的局限性傳統檢測方法往往只能聚焦于融合基因的斷裂點或融合點，而無法提供融合轉錄本的完整外顯子構成、剪接異構體信息，甚至無法區分同一基因融合點的不同剪接形式。這種“管中窺豹”式的檢測，使得我們難以全面理解融合基因的：真實結構：僅僅知道融合點不足以描繪融合基因的全貌，其上下游外顯子的排列、是否存在可變剪接等細節都對融合蛋白的功能產生關鍵影響。生物學功能：缺乏完整的轉錄本信息，就難以準確推斷融合基因的實際功能，阻礙了對致病機制的深入探索。潛在治療靶點：融合轉錄本的完整結構信息對于設計特異性靶向藥物、評估藥物敏感性至關重要。其他方法的瓶頸：特異性與通量的雙重挑戰除了短讀長測序的固有缺陷，其他一些常用檢測方法也存在各自的局限性：RT-PCR和FISH：這些方法需要預設探針，意味著它們只能檢測已知的融合類型，對于發現未知或罕見融合基因則無能為力。此外，它們的通量相對較低，難以實現高效率、全景式的融合基因篩查。文庫制備偏差：大部分基于RNA的測序方法都涉及到逆轉錄和PCR擴增步驟。這些步驟可能引入序列偏好性或擴增偏差，導致對原始RNA分子豐度的不準確評估，進一步影響融合基因的檢出和定量。面對這些挑戰，現有的融合基因檢測技術急需一次革新，能夠真正實現對融合轉錄本的精準、全面、無偏倚解析。三、“長讀長，真融合”：DRS打開全景式結構識別通道融合基因檢測之所以難，并不僅僅是因為它們稀有或結構復雜，而是因為我們缺少一種可以在單分子水平讀取完整融合轉錄本結構的技術。簡稱DRS以其天然長讀長、無需逆轉錄和擴增的測序方式，為破解這一難題提供了全新思路。與傳統方法需要重建拼接轉錄本不同，DRS直接讀取RNA分子的原始序列，通過單條讀段橫跨融合位點，不依賴拼接算法和預設假設，從而在結構還原的完整性和準確性上，具有無法比擬的優勢。原始長讀段直接跨越融合位點：還原真實結構的關鍵DRS技術的核心優勢在于其“全分子讀取”能力。一條reads即為一條天然poly(A)+RNA（即帶有多腺苷酸尾的成熟mRNA）的原始序列，讀長可達數千堿基，可以完整跨越融合位點及其上下游多個外顯子區域。這種“所見即所得”的數據模式，使融合基因的識別不再依賴間接推斷，而是直接觀察。與短讀長技術相比，DRS在以下幾個方面實現了本質性突破：消除拼接誤差：傳統短讀長依賴拼接算法將斷裂的reads重構成融合結構，常因重復序列、低質量拼接點或算法假設不足而產生假陽性。而DRS以物理連續的方式讀取整個融合轉錄本，天然避免拼接錯誤。保留上下游結構信息：不僅能夠定位融合點，還能捕獲其前后完整的外顯子組成和剪接變異，如是否存在外顯子跳躍、內含子保留、非典型連接等，提供結構層面的全景視圖。支持復雜融合識別：對于涉及大段插入、缺失、反向連接甚至非編碼區域的復雜融合結構，DRS同樣具備強大的解析能力，顯著提升對非典型、復雜或新型融合的發現概率。異構體解析能力：從“是否融合”到“融合了什么”融合基因往往不僅有一個版本。由于剪接調控的多樣性，一個融合事件可能產生多個異構體（isoforms），不同異構體間的功能差異可能非常顯著，甚至決定其是否具有致癌活性或是否構成藥物靶點。傳統方法由于讀長受限，難以區分這些異構體，常常只報告融合事件本身，無法進一步解析其結構構成。而DRS可在單分子水平上直接讀取每一個融合轉錄本的完整剪接形式：是否包含兩個基因的啟動外顯子？是否發生了外顯子跳躍或插入？是否包含3′UTR差異或poly(A)尾變化？這一能力使DRS不僅能回答“是否發生融合”，還能進一步解答“融合了什么、怎么融合、融合后表達的是什么”，為融合功能研究與靶向開發提供關鍵基礎。面向低豐度與復雜背景樣本：保持高捕獲率與低偏倚在真實樣本中，許多具有潛在臨床意義的融合基因表達量極低，或只在特定細胞群體中表達。短讀長測序往往因覆蓋深度不足而漏檢，或因算法過濾機制而被自動舍棄。DRS天然具備以下優勢：單分子信號：即使只存在極少數融合轉錄本，只要被測到，就能以一條reads完整保留；無需擴增：避免了低表達轉錄本在PCR步驟中被稀釋或擴增偏倚的風險；原始豐度保留：由于沒有逆轉錄和PCR擴增過程，DRS所觀測的表達量更接近真實生物學狀態，有利于進行準確的融合定量分析。此外，DRS還保留了每條RNA分子的天然修飾狀態與poly(A)尾信息，為下游的功能研究和穩定性判斷提供了更多維度的數據支持。從測序到機制推斷：開啟融合研究新路徑融合基因的功能不僅取決于其結構是否存在，更取決于其剪接形式、翻譯能力、修飾狀態及表達豐度等多種因素。而這些變量，正是傳統方法無法全面揭示的。DRS的出現，為我們提供了一種一站式融合檢測與機制推斷平臺：檢出融合事件；分辨異構體結構；評估其表達活躍度；揭示修飾與穩定性變化。這種從“看見結構”到“理解功能”的跨越，正是融合基因研究邁向精準與轉化的關鍵一步。四、實錘在手：來自前沿研究與真實數據的驗證4.1構建完整融合轉錄本：DirectRNA測序超越短讀長的核心優勢短讀長RNA測序在融合基因檢測中具有覆蓋廣、高通量的優勢，然而其最大限制在于無法重構融合轉錄本的完整結構，僅能提供融合斷點的信息，難以解析融合事件的剪接異構體。相比之下，NanoporeDirectRNA測序憑借其長讀長、無擴增、單分子測序的特性，能夠跨越整個融合區間，直接描繪融合基因的全貌。在2025年發表于NatureMethods的項目研究中[1]，研究團隊對包括乳腺癌MCF7在內的7個人類細胞系，使用NanoporeDirectRNA測序開展系統性評估。在融合基因識別方面，研究者共識別出106個融合基因，其中79個為已知事件或在短讀長數據中也有發現。為了驗證檢測的準確性，他們選取了MCF7細胞中的12個融合基因，利用PCR方法進行驗證，全部獲得成功驗證，證明DRS在融合事件識別方面具有高度的可信度。更具意義的是，該研究強調DRS不僅可以發現融合事件，還能夠重構完整的融合轉錄本。在每個融合基因中，DRS平均檢測到了兩個由full-splice-matchreads支持的異構體，這些讀段完整覆蓋了融合轉錄本的所有外顯子邊界。這一能力使研究者得以揭示出融合基因上下游結構的多樣性，為理解其功能調控和蛋白翻譯潛力提供了堅實基礎。而這些結構復雜性，在短讀長RNA測序中則往往因拼接不完整或reads不連續而被遺漏。此外，DRS數據中也檢測到了融合事件兩側的野生型（未融合）5′和3′基因的完整轉錄本，意味著在一次測序中，研究者便能同時獲取融合與非融合狀態的全長表達信息。這種“一步到位”的數據獲取方式，不僅提高了研究效率，也為轉錄本水平的融合表達定量和功能推斷提供了前所未有的便利。綜上所述，這項研究充分展示了NanoporeDirectRNA測序在融合結構重構能力方面相較短讀長測序的顯著優勢。這種能力使得融合基因的檢測從“是否存在”提升到了“結構全貌+表達異構體+功能推斷”的新層次，為精準醫療中的融合基因分析打開了全新窗口。圖1長讀RNA序列數據檢測到的融合基因熱圖4.2融合事件的動態表達：DirectRNA測序同時提供結構與定量信息DirectRNA測序不僅具備構建融合基因完整結構的能力，更可在原始長讀段的基礎上提供每條融合轉錄本的真實表達量，為融合事件的動態調控研究打開了新的窗口。在一項發表于NucleicAcidsResearch的研究中，Schiksnis等人應用NanoporeDirectRNA測序技術，系統分析了秀麗隱桿線蟲在衰老過程中的轉錄組變化，成功識別出多個具有明確表達量的融合轉錄本，并通過RT-PCR和Sanger測序進行驗證[2]。研究者利用了LongGF工具，在衰老過程的多個時間點篩查融合事件，識別出一批表達量隨時間變化而波動的融合轉錄本，包括來自不同染色體（II與IV）的C18H9.6與clec-173的跨染色體融合。通過時間序列分析，研究者發現這些融合事件具有明確的表達趨勢，提示其可能參與衰老過程中的基因調控機制。這一研究展示了DirectRNA-seq在融合基因檢測中的一個獨特能力：不僅能發現融合，還能“看到”融合的表達動態。相比依賴拼接組裝的短讀長技術，DRS在不犧牲結構完整性的前提下，直接提供融合異構體的表達量信息，為探索融合事件的調控邏輯和生物學功能提供了更具信度的支持。圖2DRS檢測融合基因表達量隨時間變化4.3超越邊界，拓展認知：DRS賦能新型融合基因發現傳統短讀長測序在融合基因檢測中，往往受限于對已知基因邊界的依賴，難以有效發現與重復序列或轉座元件相關的復雜融合事件，而這些正是基因組變異和疾病機制中不可忽視的一部分。DirectRNA測序憑借其無偏倚的長讀長特性，展現了在發現新型和非典型融合轉錄本方面的卓越能力，極大地拓展了融合基因研究的邊界。在2021年發表于《HumanMolecularGenetics》的研究中[3]，研究團隊通過NanoporeDRS，深入分析了DUX4基因活化的人肌細胞轉錄組。值得注意的是，該研究專門關注了與LTR反轉錄轉座子（LTRretrotransposons）相關的融合轉錄本，這類融合因其重復序列的特性，是短讀長測序的傳統“盲區”和分析難點。DRS的數據清晰地揭示了DUX4基因與附近LTR元件（如HERV-K、LITR18A）形成的新型融合轉錄本。這些融合不僅包括DUX4與LTR元件的直接融合，還捕獲了這些融合轉錄本的多樣化剪接異構體。例如，研究者發現DUX4與多個不同的LTR元件（如LTR69A、LTR79等）都可以形成融合，并且這些融合轉錄本內部存在復雜的選擇性剪接事件，導致DUX4的不同外顯子被納入到融合產物中，產生多種可能的功能性變體。這項研究充分證明，DirectRNA測序能夠：突破重復序列障礙：傳統短讀長測序在重復序列區域的精確比對和拼接面臨巨大挑戰，而DRS的超長讀長能夠完整跨越這些重復序列區域，清晰地識別出與反轉錄轉座子等重復元件相關的融合事件，避免了因重復序列導致的錯誤比對和漏檢。發現非典型融合模式：DRS不依賴于預設的基因邊界，使其能夠發現任何兩個轉錄片段之間的融合，包括基因與基因間區域、重復序列或非編碼RNA之間的融合，從而揭示了基因組內更為廣泛和復雜的轉錄重排事件。解析新型剪接異構體：DRS不僅能發現全新的融合位點，還能進一步解析這些新型融合轉錄本內部的復雜剪接模式，為理解其潛在功能和生物學意義提供了寶貴線索。這項前沿研究強有力地證明，NanoporeDirectRNA測序不僅僅是已知融合基因檢測的優化工具，更是發現未知、解析復雜新型融合轉錄本的強大利器。它為我們打開了探索基因組“暗物質”中融合事件的全新窗口，對于理解疾病機制、發現新型生物標志物和治療靶點具有深遠意義。圖3DRS發現新融合基因示例4.4復雜結構融合基因的識別能力：DRS揭示跨越多個基因的融合轉錄本在基因組的復雜世界里，融合事件并非總是簡單的兩基因拼接。一些更為復雜的融合轉錄本可能橫跨多個不連續的基因座，形成傳統短讀長測序難以觸及的“多基因串聯融合”或“跳躍式融合”。這種復雜性常常導致現有技術陷入盲區，遺漏大量具有潛在生物學或臨床意義的變異。然而，NanoporeDirectRNA測序憑借其無與倫比的長讀長優勢，展現了精準識別并完整解析這類跨越多個基因、結構極其復雜的融合轉錄本的強大能力。在2020年發表于《NucleicAcidsResearch》的一項開創性研究中[4]，研究團隊利用DRS深入探索了轉錄組的復雜性。該研究明確指出，Nanopore讀長成功識別并鑒別出了多種此前未被傳統方法完整捕獲的復雜融合轉錄本。這些發現強有力地證明了DRS在解析非典型、跨基因融合事件方面的突破性能力。具體而言，該研究揭示了如下令人矚目的復雜融合模式：多源融合轉錄本：發現了源自兩個離散基因座的多個融合轉錄本。這意味著DRS能夠清晰地捕捉到不止是簡單的A-B融合，而是諸如A-C、B-D等多種排列組合，揭示了融合事件的高度復雜性。單條讀長貫穿多基因：研究者甚至觀察到，一條單一的Nanopore讀長，能夠完整覆蓋四個基因位點組成的轉錄本。此外，還有讀長同時覆蓋了兩個遠端多外顯子基因以及七個單外顯子基因的驚人案例。這些實例直觀地展示了DRS如何憑借其超長讀長，突破了傳統技術對線性結構和單一基因區域的依賴，能夠一次性、完整地捕獲并重建這些由染色體復雜重排導致的、跨度巨大且結構異常的新型融合轉錄本。其他復雜模式：研究還進一步發現了覆蓋兩個重疊基因且剪接模式一致的融合轉錄本，以及覆蓋兩個相鄰基因的反義轉錄本，還有不同剪接模式覆蓋兩個近端基因部分區域的轉錄本。所有這些復雜轉錄本的存在均通過RT-PCR方法得到了驗證，再次強調了DRS數據的高可信度。這項前沿研究不僅彌補了傳統測序在復雜融合事件識別上的空白，更深刻地改變了我們對轉錄組復雜性的認知。它清晰地表明，NanoporeDRS是精準解析和發現跨基因、結構高度復雜的融合轉錄本的終極利器，為深入理解疾病機制、挖掘新型生物標志物及指導精準醫療實踐提供了前所未有的視角和關鍵數據。圖4DRS識別的復雜結構融合基因4.5融合轉錄本不只是“結構存在”，還能翻譯成蛋白發揮功能在對腺病毒Ad5感染A549細胞轉錄組進行DirectRNA測序研究時[5]，研究者不僅發現了多達35個新的融合轉錄本，還首次通過質譜驗證了部分融合mRNA能夠被翻譯為功能性融合蛋白。研究團隊在原始DRS數據中篩選出包含多個剪接異構體的新RNA分子，其中部分融合轉錄本跨越了經典基因結構邊界，形成截斷融合ORF或新型融合ORF。例如其中一個融合蛋白由E4orf6的N端與下游DNA-bindingprotein部分融合形成一個穩定表達的新蛋白，命名為E4orf6/DBP。在蛋白質層面，WesternBlot和Massspectrometry數據均確認該融合蛋白表達。更值得關注的是功能實驗表明，敲除該融合蛋白后，病毒復制中心的形態發生顯著異常，病毒傳播能力也顯著下降。這意味著并非所有DRS檢出的融合transcripts都是轉錄噪聲，而極有可能具備真實的功能生物學意義。這一發現具有三層重要意義：DRS不再是“只看結構”的工具，它還能引導我們挖掘出真正“被翻譯”的融合蛋白；融合轉錄本的功能研究將得到極大推動，DRS可結合質譜進行多組學驗證；從“轉錄融合”到“蛋白功能”路徑已被實證，為將來精準醫療或病毒研究中融合靶點開發提供堅實依據。這一案例展示了DirectRNA-seq在融合研究中的一個非常高階應用路徑：不僅重構融合結構，揭示異構體，還能定位蛋白產物，證明其具有真實功能。相比短讀長只關注轉錄層面，這種“轉錄——翻譯——功能”的閉環分析，是融合基因研究的終極追求。圖5DRS鑒定的融合基因表達出功能蛋白4.6融合結構即異構體驗證：DirectRNA-seq捕捉轉錄本加工前的真實形態傳統意義上的“融合轉錄本”常被看作兩個原本獨立基因因重排、轉錄錯誤或病毒感染等因素而生成的異常連接。然而，DRS所呈現出的融合現象遠比預想更豐富，其中相當一部分融合結構實則反映了細胞內天然轉錄異構體的加工中間態。在2020年發表在GenomeResearch,2020的研究中，作者使用NanoporeDRS對秀麗隱桿線蟲（C.elegans）多個發育階段的轉錄組進行了系統性測序。研究團隊在全長reads中觀察到一類“融合基因”型異構體，即單條轉錄本覆蓋兩個本應獨立存在的成熟轉錄本。通過系統分析，他們發現這類reads中將近一半屬于已知的操縱子（operon）成員，即多個基因天然共轉錄而非真正“融合”。這些reads通常捕獲的是轉錄本尚未被剪接分割之前的狀態，因此可視為對已知operon結構的直接驗證[6]。更進一步，研究者指出，另一半結構雖不歸入已知operon，但很可能代表尚未注釋的新型操縱子，或是尚未完全加工完成的天然中間產物。這提示我們，在標準注釋之外，細胞仍存在大量復雜、多樣的異構體形式，而DRS提供了首次可讀、可證實的直接數據支持。與傳統短讀長依賴拼接和比對推測不同，DRS以單分子長讀段方式，一次性捕獲整個剪接上下文，使這些異構體結構得以原位確認。綜上，該研究展示了DRS在融合異構體識別中的另一項核心價值：不僅能揭示未知結構，更能驗證已有異構體模型的準確性與表達狀態，是實現“從預測走向證實”的關鍵技術平臺。五、結語：從“可疑拼圖”到“真實全貌”，融合基因檢測進入全新時代在融合基因成為精準醫學關鍵支點的當下，我們比任何時候都更需要一種能夠還原其真實結構、捕捉其表達異構體、解析其動態調控甚至功能產物的檢測技術。NanoporeDRS，不再只是測序平臺的進化版本，而是融合基因研究范式的重構者。它讓“看到融合”從短讀段的推測變為長讀長的實錘；它讓“解析結構”不再依賴算法重建，而是基于單分子的天然跨度；它讓“理解表達”不僅停留在是否存在，而是延伸到什么時候、在哪些細胞、以何種異構體形式存在；它更讓“確認功能”成為可能，使融合轉錄本從一個待注釋的序列，走向具有生物學效應的候選靶點。我們正在從“能測到融合”邁入“能讀懂融合”的新階段。DRS是當前唯一能夠在一次實驗中同時實現結構確認、表達定量與功能關聯的測序技術。它將融合基因檢測從散落的數據碎片拼圖，推進至原貌重現的整圖洞見。未來，我們對融合基因的理解不應僅停留在“是否存在”，更應邁向“結構何在、功能為何、干預可否”。DRS，正在讓這一未來提前到來。參考文獻[1]Y.Chen,J.Goeke,etal.AsystematicbenchmarkofNanoporelong-readRNAsequencingfortranscript-levelanalysisinhumancelllines.NatureMethods.2025./10.1038/s41592-025-02623-4[2]SchiksnisEC,NicastroIA,PasquinelliAE.Full-lengthdirectRNAsequencingrevealsextensiveremodelingofRNAexpression,processingandmodificationin