醫(yī)療藥品管理鈉鈣交換體基因穩(wěn)定轉染及藥物篩選細胞模型的建立

醫(yī)療藥品管理鈉鈣交換體基因穩(wěn)定轉染及藥物篩選細胞模型的建立材料與方法實驗材料1.細胞系：選用人胚胎腎293細胞（HEK293），因其易于培養(yǎng)、轉染效率高且生長迅速，適合用于基因轉染實驗。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.質粒載體：含有鈉鈣交換體（NCX）基因的真核表達質粒pEGFP-NCX，該質粒帶有綠色熒光蛋白（EGFP）標簽，便于后續(xù)觀察轉染效果。同時準備對照質粒pEGFP-N1。3.試劑：Lipofectamine3000轉染試劑、G418抗生素、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、PBS緩沖液、細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、抗-NCX抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗、ECL發(fā)光液等。4.儀器設備：CO?培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標儀、流式細胞儀等。實驗方法1.細胞培養(yǎng)與傳代-將凍存的HEK293細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍。-解凍后的細胞轉移至含10ml完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。-加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。-當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞兩次，加入1ml0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-2min，待細胞變圓、脫壁后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化。-將細胞吹打均勻，按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。2.質粒轉染-轉染前一天，將HEK293細胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細胞，使細胞在轉染時融合度達到70%-80%。-按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行操作。分別取2μgpEGFP-NCX質粒和5μlP3000試劑加入125μlOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min。另取5μlLipofectamine3000試劑加入125μlOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min。-將上述兩種溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成脂質體-質粒復合物。-棄去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞一次，每孔加入800μlOpti-MEM培養(yǎng)基。然后將脂質體-質粒復合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。-轉染6h后，棄去含轉染復合物的培養(yǎng)基，加入2ml完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。3.穩(wěn)定轉染細胞株的篩選-轉染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，計算轉染效率。-更換含有不同濃度G418的完全培養(yǎng)基進行篩選。首先進行G418致死濃度的測定，將HEK293細胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個細胞，分別加入不同濃度（0、200、400、600、800、1000μg/ml）的G418培養(yǎng)基，每個濃度設3個復孔。培養(yǎng)10-14天，觀察細胞死亡情況，確定能在10-14天內殺死所有未轉染細胞的最低G418濃度為篩選濃度。-確定篩選濃度后，將轉染細胞用胰蛋白酶消化，按1:10的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入含篩選濃度G418的完全培養(yǎng)基進行篩選。每3-4天更換一次篩選培養(yǎng)基，直至未轉染細胞全部死亡，出現(xiàn)抗性克隆。-用克隆環(huán)將抗性克隆挑出，接種到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，擴大細胞數(shù)量。4.穩(wěn)定轉染細胞株的鑒定-熒光顯微鏡觀察：將篩選得到的穩(wěn)定轉染細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，確認細胞中EGFP-NCX融合蛋白的表達。-RT-PCR檢測：提取穩(wěn)定轉染細胞和未轉染細胞的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。NCX基因的引物序列為：上游引物5’-ATGCCAGCCCTGCTGCTG-3’，下游引物5’-CTAGTTGCTGCTGCTGCTG-3’。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。-Westernblot檢測：收集穩(wěn)定轉染細胞和未轉染細胞，用細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜1h，加入抗-NCX抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗膜3次，每次10min，加入ECL發(fā)光液，暗室中曝光顯影。5.藥物篩選模型的建立與驗證-藥物處理：將穩(wěn)定轉染NCX基因的細胞接種于96孔板中，每孔接種1×10?個細胞，培養(yǎng)24h后，更換為無血清培養(yǎng)基饑餓處理12h。然后加入不同濃度的候選藥物，每個濃度設3個復孔，同時設置陰性對照組（不加藥物）和陽性對照組（已知的NCX抑制劑）。繼續(xù)培養(yǎng)24h或48h。-細胞活力檢測：采用CCK-8法檢測細胞活力。每孔加入10μlCCK-8試劑，37℃孵育1-4h，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值。計算細胞活力，細胞活力（%）=（實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值）×100%。-鈣流檢測：將穩(wěn)定轉染細胞接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后，用含鈣熒光探針Fluo-4AM負載細胞。加入不同濃度的候選藥物，用激光共聚焦顯微鏡實時觀察細胞內鈣離子濃度的變化，記錄熒光強度的動態(tài)變化曲線。-數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差（x±s）表示，采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。結果細胞轉染效果轉染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到轉染pEGFP-NCX質粒的細胞發(fā)出綠色熒光，表明EGFP-NCX融合蛋白在細胞中成功表達。轉染效率約為30%-40%。穩(wěn)定轉染細胞株的篩選與鑒定1.G418致死濃度測定：經過10-14天的培養(yǎng)，確定G418的篩選濃度為600μg/ml。2.熒光顯微鏡觀察：篩選得到的穩(wěn)定轉染細胞在倒置熒光顯微鏡下可見均勻的綠色熒光表達，表明EGFP-NCX融合蛋白在細胞中穩(wěn)定表達。3.RT-PCR檢測：從穩(wěn)定轉染細胞中擴增出NCX基因的特異性條帶，而未轉染細胞中未檢測到該條帶，說明NCX基因已成功整合到細胞基因組中并轉錄。4.Westernblot檢測：穩(wěn)定轉染細胞中檢測到NCX蛋白的表達，而未轉染細胞中未檢測到，進一步證實了NCX蛋白在穩(wěn)定轉染細胞中的表達。藥物篩選模型的驗證1.細胞活力檢測：不同濃度的候選藥物處理穩(wěn)定轉染細胞后，細胞活力發(fā)生不同程度的變化。陽性對照組（已知的NCX抑制劑）細胞活力明顯降低，表明該模型對NCX抑制劑有響應。2.鈣流檢測：加入候選藥物后，細胞內鈣離子濃度發(fā)生動態(tài)變化。陽性對照組細胞內鈣離子濃度明顯降低，說明該模型能夠檢測到NCX功能的變化。討論本研究成功建立了鈉鈣交換體基因穩(wěn)定轉染及藥物篩選細胞模型。通過脂質體介導的基因轉染方法將NCX基因導入HEK293細胞，并利用G418篩選得到穩(wěn)定轉染細胞株。經過熒光顯微鏡觀察、RT-PCR和Westernblot檢測，證實了NCX基因在細胞中的穩(wěn)定表達。藥物篩選模型的驗證結果表明，該模型能夠檢測候選藥物對細胞活力和鈣流的影響，可用于篩選作用于鈉鈣交換體的藥物。該模型具有以下優(yōu)點：一是細胞來源方便，HEK293細胞易于培養(yǎng)和轉染；二是通過EGFP標簽便于觀察轉染效果和細胞定位；三是結合細胞活力檢測和鈣流檢測，能夠從多個角度評估藥物對NCX的作用。然而，本研究也存在一定的局限性。例如，細胞模型與體內生理環(huán)境存在一定差異，篩選得到的藥物在體內的效果可能與細胞模型有所不同。未來的研究可以進一步優(yōu)化模型，如聯(lián)合使用多種細胞系或進行動物實驗，以提高藥物篩選的準確性和可靠性。結論本研究成功建立了鈉鈣交換體基因穩(wěn)定轉染及藥物篩選細胞模型，該模型可用于篩選作用于鈉鈣交換體的藥物，為相關藥物的研發(fā)提供了有效的工具。后續(xù)研究可在此基礎上進一步完善模型，推動鈉鈣交換體相關藥物的研發(fā)進程。相關試題1.本實驗選用HEK293細胞的原因不包括以下哪項？A.易于培養(yǎng)B.轉染效率高C.具有天然的鈉鈣交換體高表達D.生長迅速答案：C分析：HEK293細胞易于培養(yǎng)、轉染效率高且生長迅速，這是選用它的原因，而它本身并非天然高表達鈉鈣交換體，需要通過轉染導入相關基因，所以選C。2.質粒轉染時，P3000試劑的作用是什么？A.促進質粒與脂質體結合B.提高轉染效率C.保護質粒不被降解D.以上都是答案：D分析：P3000試劑可以促進質粒與脂質體結合，提高轉染效率，同時在一定程度上保護質粒不被降解，所以選D。3.穩(wěn)定轉染細胞株篩選時，G418致死濃度測定的目的是？A.確定能殺死所有細胞的濃度B.確定能在最短時間內殺死細胞的濃度C.確定能在10-14天內殺死所有未轉染細胞的最低濃度D.確定能殺死一半細胞的濃度答案：C分析：進行G418致死濃度測定是為了找到能在10-14天內殺死所有未轉染細胞的最低G418濃度作為篩選濃度，所以選C。4.以下哪種方法不能用于鑒定穩(wěn)定轉染細胞株中NCX基因的表達？A.熒光顯微鏡觀察B.流式細胞術C.RT-PCRD.Westernblot答案：B分析：熒光顯微鏡可觀察EGFP-NCX融合蛋白的表達，RT-PCR檢測基因轉錄情況，Westernblot檢測蛋白表達情況，而流式細胞術在本題中未用于鑒定NCX基因表達，所以選B。5.藥物篩選模型中，CCK-8法檢測細胞活力的原理是？A.檢測細胞內的酶活性B.檢測細胞內的蛋白質含量C.檢測細胞的代謝活性D.檢測細胞的凋亡情況答案：C分析：CCK-8法是通過檢測細胞的代謝活性來反映細胞活力的，所以選C。6.實驗中使用的Opti-MEM培養(yǎng)基的作用是？A.提供細胞生長所需的營養(yǎng)B.降低血清對轉染的影響C.促進細胞貼壁D.調節(jié)細胞的滲透壓答案：B分析：Opti-MEM培養(yǎng)基血清含量低，可降低血清對轉染的影響，更適合轉染操作，所以選B。7.轉染6h后更換培養(yǎng)基的原因是？A.去除未進入細胞的質粒B.去除轉染復合物，減少對細胞的毒性C.提供更多的營養(yǎng)物質D.調節(jié)培養(yǎng)基的pH值答案：B分析：轉染6h后更換培養(yǎng)基是為了去除轉染復合物，減少其對細胞的毒性，利于細胞后續(xù)生長，所以選B。8.以下哪種試劑用于提取細胞總RNA？A.細胞裂解液B.TRIzol試劑C.BCA蛋白定量試劑盒D.ECL發(fā)光液答案：B分析：TRIzol試劑常用于提取細胞總RNA，細胞裂解液用于提取蛋白，BCA用于蛋白定量，ECL用于Westernblot顯影，所以選B。9.穩(wěn)定轉染細胞株擴大培養(yǎng)時，一般選用的培養(yǎng)容器是？A.96孔板B.24孔板C.T25培養(yǎng)瓶D.6孔板答案：C分析：擴大培養(yǎng)細胞數(shù)量時，T25培養(yǎng)瓶空間較大，適合細胞大量生長，96孔板和24孔板多用于藥物篩選等小體積實驗，6孔板常用于轉染等操作，所以選C。10.鈣流檢測中，F(xiàn)luo-4AM探針的作用是？A.標記細胞B.檢測細胞內鈣離子濃度C.促進細胞內鈣離子流動D.增強細胞的熒光信號答案：B分析：Fluo-4AM是含鈣熒光探針，用于檢測細胞內鈣離子濃度的變化，所以選B。11.本實驗中脂質體-質粒復合物形成的時間是？A.室溫孵育5minB.室溫孵育10minC.室溫孵育20minD.室溫孵育30min答案：C分析：按照操作步驟，脂質體-質粒復合物需室溫孵育20min形成，所以選C。12.以下哪種因素不會影響質粒轉染效率？A.細胞的融合度B.質粒的純度C.轉染試劑的用量D.培養(yǎng)箱的溫度答案：D分析：細胞融合度、質粒純度、轉染試劑用量都會影響轉染效率，而培養(yǎng)箱溫度一般固定在37℃，不是影響轉染效率的關鍵因素，所以選D。13.穩(wěn)定轉染細胞株篩選過程中，更換篩選培養(yǎng)基的時間間隔是？A.1-2天B.3-4天C.5-6天D.7-8天答案：B分析：篩選過程中每3-4天更換一次篩選培養(yǎng)基，以保證篩選效果，所以選B。14.RT-PCR實驗中，退火溫度的設定依據(jù)是？A.引物的長度B.引物的GC含量C.模板的濃度D.以上都是答案：D分析：退火溫度的設定需要考慮引物的長度、GC含量以及模板的濃度等因素，所以選D。15.Westernblot實驗中，封閉的目的是？A.防止抗體非特異性結合B.增強抗體的結合能力C.提高膜的穩(wěn)定性D.去除膜上的雜質答案：A分析：封閉是為了防止抗體與膜上非特異性位點結合，減少背景干擾，所以選A。16.藥物篩選實驗中，陰性對照組的設置是？A.不加任何藥物B.加入已知的無效藥物C.加入低濃度的候選藥物D.加入高濃度的候選藥物答案：A分析：陰性對照組是不加任何藥物的組，用于對比觀察藥物對細胞的影響，所以選A。17.細胞培養(yǎng)過程中，胰蛋白酶-EDTA消化液的作用是？A.去除細胞表面的雜質B.使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離C.促進細胞的分裂D.調節(jié)細胞的滲透壓答案：B分析：胰蛋白酶-EDTA消化液可以分解細胞與培養(yǎng)瓶壁之間的連接蛋白，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于傳代等操作，所以選B。18.本實驗中使用的PBS緩沖液的主要作用是？A.清洗細胞B.提供細胞生長所需的離子C.調節(jié)細胞的pH值D.以上都是答案：D分析：PBS緩沖液可用于清洗細胞，提供細胞生長所需的離子，調節(jié)細胞的pH值，所以選D。19.穩(wěn)定轉染細胞株鑒定時，熒光顯微鏡觀察主要觀察的是？A.細胞的形態(tài)B.細胞內的綠色熒光表達C.細胞的增殖情況D.細胞的凋亡情況答案：B分析：由于質粒帶有EGFP標簽，熒光顯微鏡主要觀察細胞內綠色熒光表達情況來確定轉染效果，所以選B。20.藥物篩選模型中，鈣流檢測使用的儀器是？A.酶標儀B.流式細胞儀C.激光共聚焦顯微鏡D.PCR儀答案：C分析：激光共聚焦顯微鏡可實時觀察細胞內鈣離子濃度的動態(tài)變化，用于鈣流檢測，所以選C。21.轉染實驗中，P3000試劑和Lipofectamine3000試劑分別與Opti-MEM培養(yǎng)基混合后，室溫孵育的時間是？A.相同，都是5minB.P3000試劑5min，Lipofectamine3000試劑10minC.P3000試劑10min，Lipofectamine3000試劑5minD.相同，都是10min答案：A分析：P3000試劑和Lipofectamine3000試劑分別與Opti-MEM培養(yǎng)基混合后，室溫孵育時間都是5min，所以選A。22.穩(wěn)定轉染細胞株篩選過程中，出現(xiàn)抗性克隆的時間一般是？A.1-2天B.3-5天C.7-10天D.10-14天答案：D分析：在加入G418篩選10-14天左右會出現(xiàn)抗性克隆，所以選D。23.RT-PCR實驗中，PCR反應的延伸溫度一般是？A.55℃B.72℃C.95℃D.以上都不是答案：B分析：PCR反應的延伸溫度一般是72℃，所以選B。24.Westernblot實驗中，HRP標記的二抗的作用是？A.識別一抗B.催化底物發(fā)光C.增強信號強度D.以上都是答案：D分析：HRP標記的二抗可識別一抗，催化底物發(fā)光，增強信號強度，便于檢測，所以選D。25.藥物篩選實驗中，細胞活力的計算方法是？A.（實驗組吸光度值/陽性對照組吸光度值）×100%B.（實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值）×100%C.（陰性對照組吸光度值/實驗組吸光度值）×100%D.（陽性對照組吸光度值/實驗組吸光度值）×100%答案：B分析：細胞活力（%）=（實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值）×100%，所以選B。26.細胞培養(yǎng)過程中，胎牛血清的作用不包括以下哪項？A.提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質B.促進細胞貼壁C.抑制細胞的凋亡D.調節(jié)細胞的滲透壓答案：D分析：胎牛血清可提供營養(yǎng)物質、促進細胞貼壁、抑制細胞凋亡，調節(jié)滲透壓不是其主要作用，所以選D。27.轉染實驗中，脂質體-質粒復合物加入細胞培養(yǎng)孔后，需要進行的操作是？A.立即搖晃培養(yǎng)板B.輕輕搖勻C.靜置培養(yǎng)D.以上都不是答案：B分析：加入脂質體-質粒復合物后需輕輕搖勻，使復合物均勻分布在細胞周圍，所以選B。28.穩(wěn)定轉染細胞株鑒定時，RT-PCR產物的檢測方法是？A.熒光定量PCRB.瓊脂糖凝膠電泳C.聚丙烯酰胺凝膠電泳D.以上都不是答案：B分析：RT-PCR產物一般用瓊脂糖凝膠電泳進行分離和檢測，所以選B。29.藥物篩選模型中，鈣流檢測時細胞內鈣離子濃度降低可能表示？A.鈉鈣交換體功能被抑制B.鈉鈣交換體功能被激活C.細胞代謝增強D.細胞凋亡增加答案：A分析：鈉鈣交換體功能被抑制時，細胞內鈣離子外流減少，鈣離子濃度可能降低，所以選A。30.細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的pH值一般控制在？A.6.0-6.5B.6.5-7.0C.7.0-7.4D.7.4-7.8答案：C分析：細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基pH值一般控制在7.0-7.4之間，所以選C。31.轉染實驗中，影響轉染效率的最重要因素是？A.細胞的狀態(tài)B.質粒的大小C.轉染試劑的品牌D.培養(yǎng)箱的濕度答案：A分析：細胞的狀態(tài)，如融合度、生長活力等對轉染效率影響最大，所以選A。32.穩(wěn)定轉染細胞株篩選時，G418篩選的持續(xù)時間是？A.直到所有細胞死亡B.直到出現(xiàn)抗性克隆C.1-2周D.2-3周答案：B分析：G418篩選持續(xù)到出現(xiàn)抗性克隆為止，所以選B。33.RT-PCR實驗中，引物設計的原則不包括以下哪項？A.引物長度適中B.引物的GC含量合適C.引物與模板完全互補D.引物的3’端可以有多個連續(xù)的G或C答案：D分析：引物的3’端應避免有多個連續(xù)的G或C，以免出現(xiàn)非特異性擴增，所以選D。34.Westernblot實驗中，轉膜的目的是？A.將蛋白從凝膠轉移到膜上B.增強蛋白的活性C.提高蛋白的穩(wěn)定性D.去除蛋白中的雜質答案：A分析：轉膜是為了將SDS-PAGE電泳分離后的蛋白轉移到PVDF膜上，便于后續(xù)檢測，所以選A。35.藥物篩選實驗中，陽性對照組的作用是？A.驗證模型的有效性B.對比不同藥物的效果C.確定藥物的最佳濃度D.以上都是答案：A分析：陽性對照組使用已知的有效藥物，用于驗證模型對藥物的響應能力，即驗證模型的有效性，所以選A。36.細胞培養(yǎng)過程中，CO?培養(yǎng)箱中CO?的作用是？A.調節(jié)培養(yǎng)基的pH值B.提供細胞呼吸所需的氣體C.促進細胞的生長D.以上都是答案：A分析：CO?培養(yǎng)箱中CO?的主要作用是與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖體系共同調節(jié)培養(yǎng)基的pH值，所以選A。37.轉染實驗中，脂質體-質粒復合物的形成與以下哪種因素無關？A.孵育時間B.孵育溫度C.試劑的用量D.細胞的數(shù)量答案：D分析：脂質體-質粒復合物的形成與孵育時間、溫度、試劑用量有關，與細胞數(shù)量無關，所以選D。38.穩(wěn)定轉染細胞株鑒定時，Westernblot檢測的是？A.基因的轉錄水平B.蛋白的表達水平C.細胞的代謝水平D.細胞的增殖水平答案：B分析：Westernblot檢測的是蛋白的表達水平，所以選B。39.藥物篩選模型中，細胞活力檢測時，CCK-8試劑的孵育時間一般是？A.1-2hB.1-4hC.4-6hD.6-8h答案：B分析：CCK-8試劑孵育1-4h后進行吸光度測定，所以選B。40.細胞培養(yǎng)過程中，當細胞融合度達到多少時進行傳代培養(yǎng)比較合適？A.50%-60%B.60%-70%C.80%-90%D.90%-100%答案：C分析：細胞融合度達到80%-90%時進行傳代培養(yǎng)比較合適，此時細胞生長狀態(tài)良好，所以選C。41.轉染實驗中，Opti-MEM培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基相比，其特點是？A.營養(yǎng)成分更豐富B.