基因診斷和基因治療-ppt課件

1、基因診斷和基因治療南通大學醫學院生化教研室沈 勤.概念： 基因是攜帶生物遺傳信息的根本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列?；虻母膭?，會導致各種表型的改動，進而引起疾病的發生。 將基因或其組成部分發生異常的疾病統稱為基因病。.基因病分為三大類：一、單基因?。?由單個基因突變引起的一類疾病。 如：血友病、地中海貧血等。二、多基因?。河啥鄠€基因突變綜協作用引起的 疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動脈硬化、 糖尿病、先天畸形等、三、獲得性基因?。褐竿庠椿駾NA侵入， 在機體產生疾病，一旦將其去除便可痊愈。 如：艾滋病及各種微生物感染病。.第一節 基因診斷 DNA diagnosis一、基因診

2、斷的概念和根本概略臨床診斷生化學診斷免疫學診斷臨床疾病診斷四種方式：以疾病表型改動為根據。細胞形狀構造變化、代謝產物異常、特定蛋白分子識別差別等基因診斷對患者基因直接分析.基因診斷定義概念： 基因診斷是利用現代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接檢測患者體內基因構造及其表達程度能否正常，從而對疾病作出診斷或輔助診斷。 基因診斷是在DNA/RNA程度檢測分析基因的存在、構造變異和表達形狀，與傳統診斷方法比較有其特點：.基因診斷的特點：1、病因診斷：直接瞄準病理基因，不僅對表型出現的疾病作出診斷，還能夠發現潛在的致病要素，如: 確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因。2、特異性強、靈敏度高：選用特定基

3、因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴增PCR技術。3、穩定性高4、診斷范圍廣，順應性強目的基因能否處于活化形狀均可。樣品可長期保管。可檢測正在生長的病原體或潛在病原體。與以疾病表型改動為根據的 診斷技術相比.基因診斷的根本概略：伴隨分子生物學實際技術的開展而建立和開展。DNA雙螺旋 遺傳密碼破譯 DNA重組 癌基因與抑癌基因研討 地中海貧血病基因治療和逆轉錄病毒載體開發 PCR、分子雜交等一系列技術開展.二、基因診斷的對象1、病原生物的侵入病原體：病毒、支原體、細菌、寄生蟲檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學方法、基因診斷等。尤其是當無抗體時，基因診斷成為獨一手段。2、先天遺傳性疾病遺傳性疾病: 發病

4、的緣由為特定基因的突變。.腫瘤的發生： 發病機理尚不請。 初步以為是個別細胞基因突變而引起的 細胞無限增殖.包括抑癌基因和癌基因3、后天基因突變引起的疾病二、基因診斷的對象. 1用中心順序的串聯反復序列組成探針進展雜交研 究，可同時檢出具有高度多態性位點。 2用southern 雜交得到DNA指紋圖譜個體識別、親子鑒定、法醫人證4、其他二、基因診斷的對象遺傳穩定，個體特異，因此用于法醫和親子鑒定。.基因診斷的根本戰略：1、檢測知的能產生某種特定功能蛋白的基因 這些基因根據其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測定，致病時的基因改動亦較清楚。如：已被克隆的病毒、細菌、霉菌和寄生蟲的

5、基因、 與致病有關的癌基因、抗癌基因、 地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。.2、檢測與某種遺傳標志連鎖的致病基因遺傳連鎖同一染色體相鄰的二個或二個以上的基因或限制性酶切位點，由于位置非常接近，在遺傳時分別幾率很低，常一同遺傳稱連鎖。染色體遺傳連鎖圖用限制性內切酶酶切位點作遺傳標志，定位與之相連鎖的正?；蚺c致病基因，建立相應的遺傳連鎖圖譜。定位性克隆根據遺傳連鎖圖進展定位性克隆。比較正常和異常基因的差別，可找出導致遺傳病的分子缺陷。定位性克隆戰略是當前基因診斷的重要根底。.3、檢測表型克隆基因針對多基因病如：重度肥胖、哮喘、高血壓、癲癇、精神病、多種本身免疫性疾病。表型克隆技術是將有關表型與

6、基因構造結合，直接分別該表型的相關基因，并對疾病相關的一組基因進展克隆，然后用作多種探針，來診斷多基因遺傳病。該戰略既不需預先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受基因數目及其相互作用方式的影響。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和異?；蚪M尋覓兩者之間的差別序列2、基因組錯配挑選技術：尋覓兩者的全同序列，分別、鑒定與疾病相關的基因，確定導致疾病的分子缺陷.基因診斷的根本步驟：1、獲得待檢樣品：提取核酸 PCR提高靈敏度) 2、制備和標志核酸探針3、基因檢測分析 .三、基因診斷的常用技術核酸分子雜交聚合酶鏈反響PCR限制性片段長度多態性RELP擴增片段長度多態性AFLP等位基因特異的寡核苷酸

7、ASO單鏈構象多態性SSCP基因芯片.1、核酸分子雜交原理： 利用核酸的變性、復性及堿基互補的性質，用知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA/RNA雜交，檢測核酸樣品中能否存在與探針互補的同源核酸序列，進展DNA或RNA定性定量分析?；驒z驗的兩個必要條件：1、必需的特異探針標志的2、必需的基因組DNA.核酸分子雜交核酸印跡雜交DNA印跡雜交 Southern blotRNA印跡雜交 Nouthern blot斑點印跡雜交 Dot-blot原位雜交 (situ hybridization).核酸印跡雜交根本過程：提取DNA或RNA 酶切 凝膠電泳 膠變 性處置DNA 轉印核酸片段到

8、NC膜上。 RNA可直接用變性膠電泳，轉膜1、制備樣品：.核酸印跡雜交根本過程：2制備探針：探針：一段能和待檢測核酸分子按堿基互補配對 原那么而結合的核酸分子片段。 探針需求標志可直接檢測的元素或分子。 如：同位素、熒光、生物素等.核酸印跡雜交根本過程：核酸印跡雜交可檢測pg程度的靶分子4檢測： 方法依標志的探針而不同 *放射性同位素 *生物素 *地高辛 *熒光素3雜交： 預雜交封鎖非特異性結合位點 雜交探針與核酸分子結合.核酸印跡雜交根本過程：.2、聚合酶鏈反響PCR)原理：以待擴增DNA為模板，在互補模板兩端序列的寡核苷酸引物介導下，經過耐高溫DNA聚合酶催化下，按半保管復制機制延模板鏈延

9、伸，快速、特異地擴增特定的DNA。一種體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術。無細胞分子克隆技術。.耐高溫DNA聚合酶Taq酶寡核苷酸引物：設計引物和確定退火溫度是PCR 勝利的關鍵。PCR的根本過程：循環程序 變性95 退火5565 延伸72 35分401分100bp/1分源自水棲高溫菌，最適反響溫度為72，且經90以上加溫后仍可在溫度恢復后復性。.呈2n 擴增速度PCR根本過程和原理特點：特異性強 靈敏度高樣品可以是： 毛發、血痕 單細胞、 病原體、 腫瘤殘留物、 犯罪現場遺留物.基因診斷中常用的PCR技術：1、DNA PCR：2、RT- PCR：以DNA為模板，擴增特定核苷酸序列。用于

10、檢測特定基因片段的存在，分析鑒定基因突變。以總RNA或mRNA為模板，逆轉錄為cDNA后擴增。用于檢測特定基因表達程度的主要方法之一。3、PCR-SSCP：檢測基因未知突變的常用技術。簡單、快捷、靈敏。.4、多重 PCR：指在一次PCR反響中參與多對引物，同時擴增DNA序列上不同序列片段的一種PCR技術。用于一些“超大基因中大片段缺失分析。5、原位 PCR：直接用組織切片和細胞進展PCR或RT-PCR，在組織、細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特點基因序列。6、實時定量 PCR：借助特異性結合DNA的熒光染料，實時動態檢測PCR擴增的DNA量的變化。.其他重要的PCR衍生技術反向PCRIPCR標志引

11、物PCRlabelled primers PCR錨定PCRanchored PCR差別展現PCRDD-PCR見書“分子生物學技術章節.3、限制性片段長度多態性RFLP檢出方法： Southern 印跡概念：用同一限制性內切酶完全切割同一物種的不同個體的基因組DNA，出現分子質量不同的同源片段，這種由限制性內切酶酶切位點變化導致的DNA片段差別，稱限制性片段長度多態性RFLP。人類基因組中由中性突變導致個體間核苷酸的差別稱DNA多態性.RFLP類型：2、由于鏈內發生較大片段的缺失、反復、插入和重 排導致DNA順序的變化，因此酶切片段改動 序列多態性。1、單個堿基的突變引起酶切位點的變化 點多態性

12、致病基因附近或內部普通存在RFLP,可用于連鎖分析的基因診斷。.四擴增片段長度多態性AFLP 運用于基因突變性質不明的連鎖分析。AFLP串聯反復的短片段的長度多態性經過PCR擴增,經限制性內切酶酶切后電泳,產生顯示擴增片段多態性。 .AFLP原理： 首先利用可產生粘性末端的限制性內切酶酶切研討對象的基因組序列，產生不同長度的酶切片段。然后，將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭銜接，構成模板。為到達選擇性擴增的目的，再在模板末端添加具有選擇性核苷酸13個的不同引物，然后PCR擴增，結果只需那些兩端序列與選擇性核苷酸配對的酶切片段被擴增。最后將被擴增的片段在高分辨率的測序凝膠上電泳，這

13、樣其多態性即根據擴增片段的長度與數量的不同而被分開。 PCR擴增產物即等位片段之間差別只需幾個bp。.5、等位基因特異的寡核苷酸ASO方法：1、合成兩種探針： 知突變位點的核苷酸序列M 正?；驂A基序列N2、雜交實驗結果：M+ N- 受檢者是突變基因的純合子 M- N+ 受檢者是不存在突變基因M- N- 受檢者的缺陷基因能夠是一種新的突變類型M+ N+ 受檢者是突變基因的雜合子原理： 知基因突變部位和性質，合成基因特異的核苷酸探針20bp，標志后與受檢者DNA雜交診斷。可與PCR聯用：PCR-ASO.6、單鏈構象多態性SSCP日本Orita等研討發現，單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，當有一

14、個堿基發生改動時，會或多或 少地影響其空間構象，使構象發生改動，空間構象有差別的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，經過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常 敏銳地將構象上有差別的分子別分開. PCR-SSCP.PCR-SSCP根本過程PCR擴增靶DNA將特異的PCR擴增產物變性后快速復性;將單 鏈DNA進展非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;經過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯 色分析結果.假設發現單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發生改動，就可以斷定該鏈構象發生改動，進而推斷該DNA片段中有堿基突變. .7、基因芯片 將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標志的樣品進展

15、雜交，經過檢測根據雜交分子和未雜交分子信號的強弱進而判別樣品中靶分子的數量。根本原理：生物集成模片、DNA陣列、或寡核苷酸微芯片.基因芯片技術：.目的：檢測外源性基因的侵入目的：1、微生物2、病毒 如： HIV致艾滋病 AIDS3、寄生蟲、4、不易體外培育的病原體毒性大腸桿菌、麻風分枝 桿菌5、實驗室培育的病原體克立氏體四、基因診斷的 臨床運用:1、在感染性疾病檢測中運用.艾滋病與HIV病毒艾滋病由HIV經過接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。HIV特異地進犯輔助性T細胞CD4，引起人體細胞免疫嚴重缺陷，導致頑固的時機性感染，惡性腫瘤和神經系統損傷。HIV 感染后，95%感染者5個月可檢出抗

16、體也有3-4年仍不能檢出抗體。有必要進展PCR技術檢測。.艾滋病與HIV病毒檢測技術：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的設計：應在保守區基因：pol, env, gag, tat)病毒特點：HIV病毒由兩條單鏈RNA組成，9.7k / RNA，主要基因構造和組成構成與其他逆轉錄病毒一樣，但較之復雜，故稱復雜反轉錄病毒HIV屬反轉錄病毒即單鏈RNA反轉錄成雙鏈DNA，進入宿主細胞染色體。.非典型性肺炎SARS由一種新型冠狀病毒SARS-CoV引起，多種途徑傳播，傳染性強、高致死率的急性疾病。診斷依托： 流行病學、臨床表現、放射診斷、 血清學熒光免疫、ELISAPCR作為一種靈敏

17、的早期病原學診斷必不可少 關鍵是引物的合成.2、在遺傳病檢測中的運用 產前診斷 檢測妊娠812周的絨毛DNA或羊水細胞 PCR診斷一系列遺傳疾病 鐮刀狀細胞貧血的診斷 方法：RFLP診斷 Mst酶切識別序列：CCTNAGG 切割正常鏈序列：CCTGAGG 不切割突變序列：CCTGTGG ASO探針診斷.3、在腫瘤檢測中的運用原癌基因 生物正常細胞基因中編碼關鍵性調控蛋白的 癌基因抑癌基因 一類抑制細胞增殖的基因，其失活可引起細 胞轉化。兩類基因協同調控，使細胞生優點于平衡形狀。.癌基因激活變化及檢測：1、基因擴增：即染色體某區段基因拷貝數添加，或癌基 因的擴增。檢測方法： Southern 雜

18、交 定量PCR2、基因的過量表達：包括基因擴增根底上的過量表達及非 DNA程度的過量表達。檢測方法： Northern 雜交 RT-PCR3、點突變： 檢測方法為各種基于PCR的方法。.抑癌基因的檢測：Southern PCR大片段的缺失、和點突變*兩個等位抑癌基因突變才干引起腫瘤，需檢出兩個等位抑癌基因。方法：RFLP結合PCR，進展缺失檢測 點突變主要采用PCR.腫瘤標志物：指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細 胞異常產生的物質或宿主對腫瘤反響而產 生的物質。1酶類腫瘤標志物2激素類標志物3胚胎抗原4特殊蛋白標志物5糖蛋白類抗原6血中癌基因蛋白7唾液酸和唾液酸酰基轉移酶8多胺免疫組化挑選提

19、高檢出率.法醫學鑒定針對人類DNA 遺傳差別進展的個體識別和親子鑒定。常用技術:DNA指紋分析VNTR短串聯反復序列STR遺傳特征分析PCR-擴增片段長度多態性AmP-FLP)PCR-mtDNA技術根據可變串聯反復序列小衛星DNA多態性 高度的個體特異性.DNA指紋圖譜分析：、選擇中心序列作探針，選在中心序列上無切割 位點的限制性內切酶，酶解樣品， Southern blot得到DNA指紋圖譜。 針對可變串聯反復序列VNTR VNTR是判別個體的遺傳標志、針對VNTR側翼保守區序列設計探針，用PCR 對該區擴增，電泳得到個體之間長度不同的條 帶圖譜。VNTR片段較長PCR不易擴增。.第二節 基

20、因治療gene therapuy)概念： 將外源正?；驅氚屑毎约m正或補償因缺陷和異?；蛞鸬募膊?，到達治療目的。導入的基因可以與缺陷基因對應、在體內表達具有特異功能的同源基因、也可以是與缺陷基因無關的治療基因。概念的擴展：凡是采用分子生物學方法原理，將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發揚作用，到達治療目的的方法，都可稱為基因治療。.基因治療戰略:總原那么：直接補替缺陷基因抑制非正?；虍a物表達間接調理機體本身免疫系統的抗病才干。利用外源基因對病變細胞呵斥特異性殺傷.1、基因矯正將致病基因的堿基進展糾正，而正常部分予以保管。2、基因置換用正常基因經過體內基因同源重組，原位置換病

21、變細 胞內的致病基因，使細胞內的DNA完全恢復正常3、基因增補將目的基因導入病變細胞或其它細胞，不去除異常 基因，而是經過目的基因的非定點整合，使其表達 產物補償缺陷基因的功能或使原有功能得以加強。4、基因失活利用反義技術特異封鎖基因表達，抑制有害基因 的表達。 5、免疫調理將抗體、抗原或細胞因子的基因導入病人體內， 改動病人免疫形狀，到達預防和治療的目的?；蛑委煹膽鹇裕?6、調理性基因治療： 導入編碼調控蛋白的基因，治療 基因表答異常的疾病7、化療維護性基因治療： 導入單相或多相細胞毒性藥 物的抗性基因，使正常細胞耐受化療藥物的才干大 大提高。8、特異性細胞殺傷性基因治療：利用DNA重組技

22、術構建 特異性殺傷靶細胞為目的的“奇特彈頭，“彈頭部分是 分子重組的各種生物細胞毒素，它們以酶催化方式發揚 抑制蛋白合成作用，呵斥細胞殺傷。9、生殖細胞基因治療：生殖細胞或胚胎干細胞補償性治療.基因治療根本程序;方法：1、體外法ex vivo):2、體內法 (in vivo):將受體細胞在體外培育，轉入外源基因，經適中選擇系統，將重組的受體細 胞回輸患者體內，以改善病癥。普遍采用直接將外源基因導入體內有關的組織器官,使其進入相應的細胞并轉錄、表達而發揚治療作用。根本程序：選擇目的基因選擇基因載體選擇靶細胞基因轉移外源基因表達及檢測回輸體內.治療基因的來源：1、野生型基因： 單基因缺陷遺傳病基因

23、 反義核酸封鎖活化的原癌基因 轉入相關的抑癌基因，抑制腫瘤2、重組DNA和分子克隆技術，人工合成特異 基因。1、選擇治療的目的基因.用于基因治療的基因應滿足以下條件：1體內僅少量表達就可顯著改善病癥。2該基因的過量表達不會對機體呵斥危害、3在抗病毒和抗病原體的基因治療中，所選 擇的靶基因應在病毒和病原體的生活史中 起重要作用，并且該序列是特異的。.理想的載體具有以下特征：1、容易消費 商業化消費，廣泛運用，易運輸，易保管2、繼續表達 一旦轉入體內，應能在一定時間內繼續表達基因產 物，或能經過某種方法精細調理其表達。3、弱免疫源 轉入后不應引起免疫反響。4、組織靶向性 定向輸入某種細胞。5、包裝

24、容量載體對轉染基因的大小應沒有限制。6、復制、分裂和整合才干：特異性定位整合，或以游離基因方式 存在于細胞核內。 7、能感染分裂期細胞和未分裂期細胞2、選擇基因載體：.基因載體：非病毒載體 裸DNA、脂質體 病毒載體 反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒分類：優點： 大量消費，毒性小，低免疫性缺陷：效率低。優點：多數病毒可感染特異細胞，不易降解， RNA病毒能整合到宿主染色體，表達 程度高等。.病毒介導的基因轉移1、逆轉錄病毒：正鏈RNA病毒.逆轉錄病毒構造:基因組組成：15帽子；3尾巴；2 每個單鏈RNA含6個區： 5-LTR長末端反復序列 + 組裝所需的非編碼序列 gag編碼衣殼構造蛋白基因 p

25、ol編碼反轉錄酶基因 env編碼外殼蛋白基因 3-LTR.逆轉錄病毒生活周期:1、感染靶細胞2、利用本身編碼的逆反轉錄酶，以RNA為模板合成DNA。3、將病毒DNA轉運至宿主細胞核4、病毒DNA整合到宿主染色體5、以病毒DNA為模板轉錄RNA6、在細胞中翻譯Gag、Pol和Env蛋白7、構成衣殼，RNA單鏈和反轉錄酶一同包裝進衣殼。8、構成病毒顆粒并分泌到胞外。.逆轉錄病毒病毒RNA宿主細胞RTRT逆轉錄酶cDNA雙鏈插入基因組DNA逆轉錄病毒感染過程病毒RNA.構建逆轉錄病毒載體：1構建重組野生性病毒：插入相關外源基因，改呵斥DNA載體包括插入選擇性標志，替代病毒的編碼基因。2制備輔助細胞2

26、93T細胞，為載體DNA提供其喪失的功能。3載體DNA導入輔助細胞，產生病毒載體。4用病毒載體感染細胞，外源基因在宿主細胞中表達。.逆轉錄病毒載體的缺陷：1、只能轉染處于增殖形狀的細胞2、所攜帶的外源基因不能太大。3、感染依賴靶細胞外表受體的限制4、實際上不分散其它細胞，但某些情況會呵斥 野生型病毒迸發。5、有致細胞癌變的能夠。6、逆轉錄病毒不能耐受純化和濃縮過程。.腺相關病毒(AVV )一種小的、非致病的、單鏈DNA病毒。是從屬病毒，需要其他基因才干復制。構造： rep基因編碼病毒的復制、整合功能所需蛋白 cap基因編碼病毒構造組分 ITRs序列反向末端反復，定義基因的開場和 終了，制約DN

27、A序列大小，包裹入 衣殼。細胞對AVV病毒的親和力高，AVV載體適用范圍廣泛。.骨髓細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、血管內皮細胞、肌細胞選擇原那么:1、較鞏固，耐受處置，易于由人體分別，便于輸 回體內。2、具有增殖優勢，生命周期長，能存活幾個月或幾年， 至病人的整個生命。3、易于受外源遺傳物質的轉化。4、在選用病毒載體時，目的基因具表達最好具有組織特異 性的細胞3、選擇靶細胞制止運用生殖細胞，只能用體細胞.1、骨髓細胞：最被注重和常用的靶細胞。常用細胞：優點：易接受各種處置、已積累豐富閱歷，多數遺傳疾病 涉及骨髓細胞、源自骨髓的細胞遍及全身。缺陷： -骨髓干細胞含量少占骨髓細胞0.1% -治療基因在核骨髓細胞表達時間短幾個月。 -只需部分干細胞有活性 -造血干細胞分化能夠導致基因失活。 -有些遺傳疾病與骨髓干細胞無關。2、肝細胞：是許多遺傳代謝缺陷的靶細胞。3、皮膚細胞：易于繁衍及轉化。4、淋巴細胞：易采集、分別，大量繁衍，延續 多次輸入5、癌細胞：腫瘤治療常用細胞。.方法：1、物理法：顯微注射法