微生物的營養與生長

1、第三章第三章 微生物的營養與生長微生物的營養與生長微生物的營養與生長 從生物學的觀點來看，微生物活細從生物學的觀點來看，微生物活細胞是個新陳代謝的動力系統，它從環境胞是個新陳代謝的動力系統，它從環境不斷地吸收營養物質，通過新陳代謝，不斷地吸收營養物質，通過新陳代謝，實現生長和繁殖，同時排出實現生長和繁殖，同時排出“廢物廢物”。 笫一節微生物的營養 營養物質營養物質nutriment：微生物在生命活動中從環境中吸取的用以提供能量、調節新陳代謝以及合成細胞物質的物質。在發酵工業上也包括用于合成產物。 營養營養(過程)nutrition：微生物吸收和利用營養物質的過程。 一、微生物細胞的化學組成一、

2、微生物細胞的化學組成1、元素組成：C、H、O、N、P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo。其中C、H、O、N、P占細胞干重的97%。2、物質組成(1)水：約占細胞濕重的90%。(2)有機物：主要有蛋白質、碳水化合物、脂類、核酸、維生素以及它們的合成中間體和降解物。(3)無機鹽：灰分元素是指參與有機物組成及單獨存在于細胞原生質內的無機鹽等灰分物質中的元素。3影響微生物細胞化學組成的因素(1)微生物的種類：硫細菌、鐵細菌、海洋細菌含有較多的S、Fe、Cl和Na。(2)菌齡：幼齡菌中含氮量較高。(3)培養條件：在氮源豐富的環境中生長的微生物含氮量較高。 微生物細胞元素組成部

3、分發酵產品的元素組成部分發酵產品的元素組成二二. .微生物的營養物質微生物的營養物質1、水水v水的生理功能 細胞的重要組分 微生物進行代謝活動的介質 參與部分生化反應 調節和控制細胞溫度幾種生物的游離水含量 人：60%海蟄：96%微生物：孢子：霉菌孢子：39% 細菌芽孢：皮層：70% 核心：極低 營養體：細菌：80% 酵母：75% 霉菌：85%v環境中水的存在狀態 結合水：與溶質或其它分子結合而不能被微生物所利用狀態的水； 游離水：可以被微生物所利用的水v水活度water activity aw= p/p0v微生物生長要求：aw=0.630.992.碳源 carbon sourcev凡是能被微

4、生物用來構成細胞物質或代謝產物中碳素來源的營養物質。v生理功能 提供C元素 提供能量v碳源物質 有機碳化物 無機碳化物微生物的碳源譜類型 元素水平化合物水平培養基原料水平有 機 碳CHONX復雜蛋白質、核酸等牛肉膏、蛋白胨、豆餅粉等CHON多數氨基酸、簡單蛋白質等一般氨基酸、明膠等CHO糖、有機酸、醇、脂類等葡萄糖、蔗糖、各種淀粉、糖蜜等CH烴類天然氣、石油及其不同餾分、石蠟油等無 機 碳C(?)-COC02CO2CONNaCO3、CaCO3等NaCO3、CaCO3、白堊等3.氮源 nitrogen source 凡是能被微生物用來構成細胞物質或代謝產物中氮素來源的營養物質稱為氮源 是構成細胞

5、中核酸和蛋白質的重要元素，只為少數細菌提供能量 氮源的種類 無機氮、有機氮、氣體氮微生物的氮源譜類型元素水平化合物水平培養基原料水平有 機 氮NCHOX復雜蛋白質、核酸等牛肉膏、酵母膏、豆餅粉、蠶蛹等NCHO尿素、多數氨基酸、簡單蛋白質等尿素、蛋白胨、明膠等無 機 氮NHNH3、銨鹽等（NH4）2SO4等NO硝酸鹽等KNO3等NN2空氣 速效性氮源 能夠被微生物細胞直接吸收和利用的有機氮源。 遲效性氮源 不能被微生物直接吸收，必須先經相應的水解酶降解以后，才能被細胞吸收利用的有機氮源“生理酸性鹽”與“生理堿性鹽” 生理酸性鹽 由于其陽離子中的氮被微生物選擇性吸收利用而造成培養基的pH下降的鹽。

6、如(NH4)2SO4 生理堿性鹽 由于其陰離子中的氮被微生物選擇性吸收利用而造成培養基的pH上升的鹽。如NaNO3部分發酵產物的氮源4.無機鹽類mineral salts 生理功能 參與細胞結構物質的組成； 參與酶的組成及調節酶的活性； 參與能量轉移； 調節并維持細胞滲透壓的平衡； 作為某些微生物的能源物質無機鹽的功能 大量（主要/宏量）元素 macroelements P、S、K、Na、Ca、Mg等 需要量：10-310-4M 微量元素 microelements Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo等 需要量： 10-610-8M無機鹽一般采用的濃度范圍對一些產物有影響的微量元素5.生長因子

7、 growth factor 生長因子是指微生物生長不可缺少的微量有機物質微量有機物質。 種類 維生素、氨基酸、堿基 需要量 維生素：150ug/L 氨基酸：2050ug/L 堿 基：1020ug/L 核苷或核苷酸：2002000ug/L幾種微生物的生長因子 菌種 生長因子 丙酮丁醇梭菌 對氨基苯甲酸 德氏乳桿菌 酪氨酸、胸腺核苷 干酪乳桿菌 生物素、麻黃素 糞鏈球菌 葉酸、精氨酸 腸膜明串珠菌 吡哆醛 金黃色葡萄球菌 硫胺素 向培養基中添加生長因子的措施 直接添加 添加富含生長因子的物質 酵母膏，玉米漿，肝浸汁，麥芽汁玉米漿含的氨基酸6、能源 energy source 能為微生物生命活動提

8、供最初能量來源的營養物質或輻射能能源譜 化學物質：有機物 無機物 輻射能7、氣體 （1）氧O2 ： 微生物的對氧的需求 專性好氧菌：只能在有氧的環境中生長 專性厭氧菌：只能在無氧的環境中生長 兼性厭氧菌：在有氧及無氧的環境中都能生長 微嗜氧菌： 只能在氧分壓很低的環境中生長 向微生物提供氧的措施 實驗室： 液體培養（三角瓶、試管）：淺液層、振蕩 固體培養（平板、斜面）：表面生長 大生產： 液體培養（發酵罐）：通風、攪拌 固體培養：淺層、通風（2）二氧化碳CO2 對于自養微生物：唯一或主要碳源 對于異養微生物：PiADPCOOHHOOCCOCHATPCOCOCOOHCH223丙酮酸羧化酶三、微生

9、物的營養類型三、微生物的營養類型1、微生物營養類型的分類分類標準營養類型A、能源光能營養型 phototroph化能營養型 chemotrophB、氫供體無機營養型 lithotroph有機營養型 organotroph分類標準營養類型C、碳源自養型autotroph異養型heterotrophD、生長因子原養型(prototroph)/野生型(wild type)營養缺陷型auxotrophE、合成氨基酸能力氨基酸自養型amino acid autotroph氨基酸異養型amino acid heterotrophF、取食方式滲透營養型osmotroph吞噬營養型phagotrophG、取得

10、死或活有機物腐生saproghytism寄生parasitism2、微生物的營養類型營養類型能源氫供體基本碳源實例光能無機營養型（光能自養型）光無機物CO2紫硫細菌、綠硫細菌、藻類光能有機營養型（光能異養型）光有機物CO2及簡單有機物紅螺細菌化能無機營養型（化能自養型）無機物無機物CO2硝化細菌、硫化細菌化能有機營養型（化能異養型）有機物有機物有機物絕大多數細菌和全部真核微生物光能無機營養型 photolithotroph 能源：光 主要碳源：CO2 供氫體：H2S、Na2S2O3例：綠硫細菌，紫硫細菌CO2+H2S CH2O+2S+H2O 細菌葉綠素光能有機營養型 photoorganotr

11、oph 能源：光； 主要碳源：有機物，但可以將CO2還原成細胞物質。 供氫體：有機物例：紅螺細菌2CH3CHOHCH3+CO2 2CH3COCH3+CH2O+H2O 光合色素化能無機營養型 chemolithotroph 能源：無機物，NH3 ， NO2， H2，H2S，S等 主要碳源：CO2 電子供體：無機物 例： 氧化亞鐵硫桿菌 Fe Fe + e + 11.3千卡+2+3化能有機營養型 chemoorganotroph 能源：有機物 主要碳源：有機物 例：大部分種類的微生物，工業用菌種多為此類。 營養類型的劃分不是絕對的，在自然界中存在中間類型。營養類型的劃分以最簡單的營養條件為依據，并

12、以“嚴格”,“兼性”加以區分。四四. .營養物質的跨膜輸送營養物質的跨膜輸送 微生物是通過細胞膜的滲透和選擇吸收作用而從外界吸取營養物質的。 被動吸收簡單擴散和促進擴散 主動吸收主動運輸和基團移位 原生動物膜泡運輸本部分要求掌握：輸送動力，輸送方向，是否需要載體及其特異性，被輸送物質在輸送過程中是否發生化學變化輸送物質舉例。 1.簡單擴散簡單擴散 simple diffusion 無載體蛋白參與下，單純依靠物理擴散方式輸送營養物質。 特點特點： 輸送動力：濃度梯度 輸送方向：順濃度梯度 輸送物質：水、氣體、脂溶性物質、極性小的分子 輸送機制：通過親水小孔或脂雙分子層。 J=D dc/dx J：

13、擴散速度 D：擴散系數 dc/dx：該物質的濃度梯度 影響因素：分子的大小、溶解性、極性和環境的溫度等 2、促進擴散、促進擴散 facilitated diffusion 在特異性載體蛋白的協助下，不消耗能量的一類擴散性運輸方式。 特點： 輸送動力：濃度梯度 輸送方向：順濃度梯度 載體蛋白：需要，具有特異性 輸送物質：極性大的分子， 真核微生物對糖的吸收。 輸送機制： 被輸送的物質與相應的載體之間存在一種親和力。3、主動運輸、主動運輸 active transport 在消耗能量的同時，實現溶質在細胞內的濃縮，而沒有任何化學變化發生的輸送機制。 特點： 輸送動力：代謝能量 輸送方向：逆濃度梯度

14、 載體蛋白：需要，具有特異性 輸送物質：氨基酸、某些糖、Na、K 等。 輸送機制：代謝能量改變底物與載體之間的 結合力。主動輸送主動輸送NaK泵泵4、基團移位、基團移位 group translocation 被輸送的基質分子在膜內經受了共價的改變， 以被修飾的形式進入細胞質的輸送機制 特點： 輸送動力：代謝能量, PEP上的高能磷酸鍵 輸送方向：逆濃度梯度 載體蛋白：磷酸轉移酶系統 被輸送物質在輸送前后的存在狀態：在細胞膜內被磷酸化 輸送機制：例：磷酸轉移酶系統（PTS） 酶：非特異性，存在于細胞質中 酶：特異性(誘導型)，存在于膜上 因子：特異性，存在于細胞質中 HPr(組氨酸蛋白質/熱穩

15、定蛋白質)：非特異性，存在于細胞質中5.膜泡運輸膜泡運輸 Membrane vesicle transport 通過趨化性運動靠近營養物質，將它吸附到膜表面，形成膜泡，并進入細胞質。 胞吞作用 胞飲作用四種物質運輸方式的比較四種物質運輸方式的比較基團移位主動運輸五、培養基五、培養基 medium 人工配制的含有營養物質的供微生物生長繁殖或積累代謝產物的基質（一）培養基應具有的共性n單位數量的培養基應能以最高產率地生產出所需產物，n 能最高速率地穩定合成出所需產物，n 培養基成分應價格便宜易于就近取材，n培養基有利于通風、攪拌、提取、純化和廢物處理等 （二）制備培養基的要素（1）營養物質營養物質

16、：包括研究或實驗微生物所需要的碳、氮、磷、硫等宏量元素及微量元素、生長因素及水等。在營養缺陷型（生長因素異養型）微生物的培養基中，必須配入所缺的生長因素。（2）水活度水活度：實際上是控制好培養基中可溶物質的濃度。（3）pHpH值值：指滅菌后pH值，這與pH緩沖液和緩沖物（如CaCO3）的使用有關。（4）培養基的物理狀態培養基的物理狀態（5）滅菌方法滅菌方法（三）培養基的種類培養基的種類1、按對培養基成分的了解分類、按對培養基成分的了解分類 天然培養基天然培養基complex medium；undefined medium 利用化學成分還不清楚 或不恒定的天然有機物質制成的培養基。如：實驗室用的

17、麥汁培養基 馬鈴薯浸汁培養基 大生產用山芋干粉糖化醪 一些營養物質的來源與成分一些營養物質的來源與成分玉米漿的平均化學組成玉米漿的平均化學組成( (以干物質計以干物質計) ) 合成培養基合成培養基synthetic medium，defined medium 利用化學成分完全了解的高純化學試劑制成的培養基。如：培養霉菌用的察氏培養基（g/L) NaNo3 2, K2HPO4 1, KCl 0.5, MgSO47H2O 0.5 FeSO47H2O 0.01, 蔗糖 30, 瓊脂 20, pH 自然 半合成培養基半合成培養基semi- synthetic medium 由部分天然有機物和部分化學試

18、劑制成的培養基。如：LB培養基(g/L)： Tryptone 1, Yeast Extract 5, NaCl 1, pH7.2 2、據培養基的物理狀態分類、據培養基的物理狀態分類（1）液體培養基 liquid medium 呈液體狀態的培養基 （2）固體培養基solid medium 外觀呈固體狀態的培養基 固體培養基凝固培養基（solidified medium）：遇熱可融化、冷卻后則凝固的培養基。 非可逆性凝固培養基：當凝固后就不能再融化的固體培養基。 天然固體培養基：由天然固體物質直接制成的固體培養基。 濾膜（membrane filter）：是一種堅韌且帶有無數微孔的醋酸纖維素薄膜。

19、瓊脂和明膠的區別比較內容瓊脂明膠常用濃度1.5-2.0%5-12%熔點98-10025凝固點40-4220PH微酸酸性灰分 %1614-15CaO %1.150MgO %0.770氮 %0.418.3微生物的可利用能力絕大多數微生物不能利用不少微生物能利用（3）半固體培養基semi-solid medium 呈當容器倒放時不致流下、但在劇烈振蕩后則能破散狀態的凝固性固體培養基。瓊脂的加量為0.5%左右。 3、按照培養基的特殊用途分類（1）加富培養基）加富培養基enriched medium 為分離某種微生物而專門設計， 加入了助長該類微生物的營養物質的培養基。 （2）選擇培養基選擇培養基sel

20、ected medium 加入了某種化學物質以抑制不需要的菌的生長, 從而促進目的菌生長的培養基。 （3）鑒別培養基鑒別培養基differential medium 添加了某種試劑或化學藥品而對特定的微生物起鑒別作用的培養基。一些鑒別培養基（4）種子培養基）種子培養基 seed medium 培養發酵用的健壯的種子的培養基。（5）發酵培養基）發酵培養基 fermentation medium 用于合成某種預定的發酵的培養基。（6）繁殖和保藏培養基）繁殖和保藏培養基 細 菌：營養瓊脂、LB培養基 放線菌：馬鈴薯培養基，高氏一號培養基 酵 母：麥汁培養基，YEPD培養基 霉 菌：麥汁培養基、察氏培

21、養基 （7）基礎培養基）基礎培養基：幾種相似培養基的共同部分 培養基種類（四）配制培養基應注意的問題配制培養基應注意的問題 1、營養成分的溶解 緩沖性組分；易沉淀組分；微量組分；合成培養基的組分2、pH值及水活度3、瓊脂4、滅菌（五）商品化培養基第二節 微生物的生長生長：個體體積的增大及細胞原生質總量的增加。繁殖：個體數量的增多。群體生長：包含了個體生長和繁殖一、微生物個體細胞的生長1、細菌的生長與繁殖2、絲狀菌的生長與繁殖 曲霉菌分生孢子形成的過程二. 微生物生長的測定(一) 直接計數法1、顯微計數法 酵母菌、霉菌孢子：血球計數器 細菌：Petroff-Hausser或Helber計數器 2

22、、電子自動計數法Coulter電子計數器電子計數器可測定細胞數、細胞大小分布。 （二）間接計數法（二）間接計數法1、平板菌落計數法、平板菌落計數法適用：單細胞或單孢子菌懸液方法：傾注平板、涂布平板CFU：colony-forming unit2、薄膜過濾計數法、薄膜過濾計數法 微孔濾膜如硝化纖維素薄膜適用：量大、含菌濃度低的樣品3、液體稀釋法（或然率法）、液體稀釋法（或然率法） MPN( Most probable number) 將樣品作10倍系列稀釋，接種液體試管，培養后記錄出現生長的試管數，查表并計算。 例：某一細菌在稀釋法中的 生長情況如下 稀釋度 10-4 10-5 10-6 10-

23、7 10-8 重復數 5 5 5 5 5 生長管數 5 5 4 1 0 數量指標“541”，查統計分配表17 原菌液中的活菌數=1.7106 個/dL（三）其他方法1.測定細胞物質的量測定細胞物質的量 測定細胞干重法 比濁法 測定細胞總含氮量法 2.霉菌菌絲長度的測定霉菌菌絲長度的測定 菌落直徑測定法： U型管測定法：三三. 微生物群體生長規律微生物群體生長規律（一）細菌生長曲線growth curve 將少量細菌接種到一恒定容積的新鮮液體培養基中，在適宜條件下培養，定時取樣測定細胞密度（CFU），以活細胞數的對數對培養時間所作出的曲線稱為生長曲線。細菌群體生長曲線細菌群體生長曲線 1.延遲期

24、（lag phase 調整期） 活細胞數：基本不變 細胞生理特點：分裂遲緩、代謝活躍 出現的原因：調整代謝，適應新環境 影響因素：菌種的遺傳性；種齡；接種量； 培養基組分及培養條件 縮短措施：2.對數期 log phase/exponential phase 活細胞數：呈幾何級數增加 細胞的生理特點： 細胞生長速率最大； 細胞進行平衡生長； 酶系活躍，代謝旺盛繁殖代數和世代時間 x2=x12n繁殖代數n=(lg x2- lg x1)/lg 2世代時間generation timeG=lg 2 (t2-t1)/ (lg x2- lg x1)在最適條件下幾種微生物的世代時間3、平衡期、平衡期 st

25、ationary phase 活細胞數：動態平衡 出現原因：營養物質的消耗 ；有生理毒性代謝產物的積累 ；環境條件（pH, 氧化還原電位）的改變對細胞生長不利 細胞生理特點：分裂速度降低；活細胞數達到最大值；開始積累儲藏物質；積累發酵產物；芽孢細菌產生芽孢4、衰亡期、衰亡期 decline phase/death phase 活細胞數：逐漸下降 細胞生理特點： 細胞內顆粒更加明顯，出現液泡 細胞出現異常形態 細胞死亡伴隨自溶（二）真菌的生長曲線（二）真菌的生長曲線1、酵母菌的生長曲線：與細菌相似2、絲狀真菌的生長曲線 三個時期 各期特征 生長停滯期 孢子萌發前的時期 迅速生長期 菌絲伸長及分枝

26、 衰退期 菌絲體干重下降 伴隨自溶 （三）多種碳源及復合培養基存在下（三）多種碳源及復合培養基存在下的微生物的生長的微生物的生長葡萄糖和乳糖共存時大腸桿菌的二次生長曲線麥芽糖和蔗糖共存時釀酒酵母的二次生長曲線四四.微生物的培養微生物的培養1.分批培養分批培養 batch culture 將微生物置于一定容積的培養基中，經過培養生長，最后一次收獲的培養方法。 搖瓶培養 發酵罐培養2.補料分批培養補料分批培養 適用對象： 底物對菌體生長或產物形成具有抑制作用 方法： 階段式補料 連續補料-流加發酵 3.連續培養連續培養 continuous culture 當微生物以分批培養的方式培養到對數期后，

27、向培養器中不斷補充新鮮營養物質，并以同樣速度排出培養物，使微生物的增殖速度及培養基中的總菌量保持不變的培養方法。分批培養與連續培養的關系連續培養裝置連續培養裝置恒濁連續培養恒濁連續培養 反應器：恒濁器（turbidostat） 目的： 不斷提供具有一定生理狀態的細胞， 得到以最高生長速率進行生長的培養物。 應用： 獲得大量的菌體 獲得與菌體生長相平衡的代謝產物。 不斷調節流速而使培養液的濁度(菌體密度)保持恒定的連續培養方法 恒化化連續培養恒化化連續培養控制恒定的流速，使由于菌體生長而耗去的營養物及時得到補充；培養液中營養物濃度基本恒定，從而保持菌體的恒定生長速率的連續培養方法。反應器：恒化器

28、 chemostat培養基：含一種限制性因子，其它營養成分均過量 限制性因子條件 菌體生長提供所必需的營養物質； 在一定的濃度范圍內，生長速率與其濃度呈正比關系。 限制因子的種類 氨基酸，葡萄糖，生長因子，無機鹽等SKSSmaxMonod 公式連續培養處于穩定狀態的條件連續培養處于穩定狀態的條件 D=F/V =F：培養基流入(流出)培養器的速度（ l/h）V：培養基中培養液的體積 (l)D：稀釋率，單位時間內單位體積的培養基中流入流出的量（h-1) ：比生長速率，單位時間內單位重量的微生物所形成的新的菌體的重量(h-1)連續培養的穩定狀態連續培養的穩定狀態：D=F/V =n當D = 時，處于穩定狀態n當D 時， 減小，但培養物中細胞密度加大。 n當D 時， 增大，但培養物中細胞密度減小。n當D max時，細胞被“洗出”，連續培養系統遭破壞 酒精發酵(D=0.05-0.1)連續發酵的應用 連續發酵的優點 提高設備利用率 便于自動化控制 產品質量較穩定 節省人力、物力，水、電、氣負荷均衡 連續發酵的缺點 菌種易退化 易污染雜菌 營養物質利用率低于分批發酵5.同步培養物同步培養物 synchronous culture Synchronous culture is a form of culture on which all the ce