實驗九DNA的粗提取與鑒定

1、【實驗九】DNA的粗提取與鑒定 陳小珺（江西省贛州市第三中學 341000）1 教學建議在本實驗的教學中，教師應注意以下幾點。1.1 實驗材料必須準備充足。本實驗所用的實驗材料是雞血細胞液,由活雞的鮮血經沉淀后獲得。每組(2個學生)需用5 mL 雞血細胞液,則每班(50人)至少需要130 mL,而雞血細胞液與雞血的體積比為1:3,這樣每班至少需要390 mL 雞血細胞液。宰殺1只中等大小的活雞,一般可得120 mL 左右的鮮血,因此,1個班實驗需要買4只活雞。也可以到市場售活雞處去索取雞血,但所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑。（每100ml雞血加入3g檸檬酸鈉）1.2 盛放雞血細胞液的容器,最好是

2、塑料容器。因為雞血細胞破碎后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于細胞內DNA的含量本來就比較少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就會更少。 1.3 獲取較純凈的DNA的關鍵步驟。1.3.1 充分攪拌雞血細胞液：將雞血細胞液與蒸餾水混合以后,必須用玻璃棒沿一個方向快速攪拌,使雞血細胞加速破裂,并釋放出DNA。1.3.2沉淀DNA時必須用冷酒精：體積分數為95%的酒精在冰箱中至少存放24 h。1.3.3正確攪拌含有懸浮物的溶液實驗步驟3、5、7,都需要用玻璃棒攪拌。教師應提醒學生注意,在進行步驟3、5時,玻璃棒不要直插燒杯底部,而且攪拌要輕緩,以便獲得較完整的DNA分子。進行步驟7時,

3、要將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間,用手緩慢轉動5 min。2 實驗原理的補充介紹2.1 DNA的釋放本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破。DNA位于雞血細胞的細胞核中,正常情況下不會釋放出來。為了使DNA從細胞核中釋放出來,實驗中采用了向雞血細胞液中加入蒸餾水并且攪拌的方法。蒸餾水對于雞血細胞來說,是一種低滲液體,水分可以大量進入血細胞內,使血細胞破裂。同時,再加上攪拌的機械作用,就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂),于是釋放出DNA,當然也有RNA。但是,釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質結合在一起。2.2

4、將DNA與蛋白質分離根據二者的特性,即在濃度較高的氯化鈉溶液(物質的量濃度為2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游離出DNA。而DNA在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高,Na+與帶負電的DNA結合成DNA鈉鹽。這時DNA在溶液中呈溶解狀態。2.3 DNA的析出與獲取利用DNA在濃度較低的氯化鈉溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的濃度較高的氯化鈉溶液中加入大量(300 mL )蒸餾水,稀釋氯化鈉溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白質的溶解度增高(這就是蛋白質的鹽溶現象),從而使二者分離。這時,加上不停地攪拌,溶解度下降的DNA逐漸呈絲狀物。再通過過濾,濾去蛋白質,就可以獲取DNA的黏稠物了。如

5、果采用離心法則更好,用4 000 r/min 的旋轉頻率,離心15 min ,除去上清液(含有蛋白質),留下的沉淀物中含DNA。2.4 DNA的再溶解再用較高濃度的氯化鈉溶液去溶解DNA黏稠物。2.5 DNA的沉淀和濃縮除去了蛋白質的核酸溶液,必須再進一步沉淀和濃縮。最常用的方法是酒精沉淀法。就是將含有Na+的DNA溶液,加入到相當于其兩倍體積的體積分數為95%冷酒精溶液中（實驗一般要求采用預冷的95的乙醇，但對比結果顯示，常溫下的乙醇溶液也可產生明顯效果。從理論上分析，預冷的乙醇溶液具有以下優點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加D

6、NA分子柔韌性，減少斷裂。）,混勻以后可以使DNA沉淀、濃縮,形成含雜質較少的DNA絲狀物,懸浮于溶液中。如果出現的絲狀物較少,可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分。濃縮后的DNA絲狀物,可以用緩緩旋轉玻璃棒的方法卷起(因為玻璃棒有吸附DNA的作用)。2.6 DNA的鑒定本實驗中鑒定DNA的方法為二苯胺法。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成-羥基-酮基戊醛,它再和二苯胺作用而顯現藍色(溶液呈淺藍色)。鑒定時溶液藍色的深淺,與溶液中DNA含量的多少有關。3 幾種新材料的DNA粗提取與鑒定介紹3.1新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)DNA粗提取與鑒定一.材料用具新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)。

7、塑料燒杯,量筒,玻璃棒,尼龍紗布,陶瓷研缽,試管,試管架,試管夾,漏斗,酒精燈,石棉網,三角架,火柴,刀片,天平。研磨液,體積分數為95%的酒精溶液,二苯胺試劑,蒸餾水。 二.方法步驟(1)DNA的粗提取準備材料 將新鮮菜花和體積分數為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室,至少24 h。取材 稱取30 g菜花,去梗取花,切碎。研磨 將碎菜花放入研缽中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。過濾 在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液濾入燒杯中(有條件的學校可將濾液倒入塑料離心管中進行離心,用1 000r/min的旋轉頻率,離心25 min,取上清液放入燒杯中)。在4S冰箱中放置幾分后,再取上清液

8、。加冷酒精 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數為95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒緩緩地輕輕攪拌溶液(玻璃棒不要直插燒杯底部)。沉淀35 min后,可見白色的DNA絮狀物出現。用玻璃棒緩緩旋轉,絮狀物會纏在玻璃棒上。(2)DNA的鑒定配制二苯胺試 劑取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混勻。鑒定 取4 mL DNA提取液放入試管中,加入4 mL 二苯胺試劑,混勻后觀察溶液顏色(不變藍)。用沸水浴(100 )加熱10 min 。在加熱過程中,隨時注意試管中溶液顏色的變化(逐漸出現淺藍色)。3.2洋蔥DNA粗提取實驗與鑒定（值得推介，它取材容易，操作簡便，效果明顯。）一、實驗原理洗

9、滌劑等去污劑可以溶解細胞的細胞壁，破壞細胞膜，同時也能使蛋白質變性。當細胞壁破壞后，細胞釋放出核酸與蛋白質形成的復合物核糖核蛋白(RNP)和脫氧核糖核蛋白(DNP)，這兩種復合物在不同電解質溶液中的溶解度有較大差異。當NaCl濃度達到0.14molL時，DNP溶解度約為純水中溶解度的1，但RNP則不一樣，在0.14molL NaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相當大，因此在制備DNA時，利用0.14molL稀鹽溶液使DNP與RNP分開。 去除蛋白質后的核酸鹽溶液，再利用其不溶于有機溶劑的性質，但細胞中的其他物質則可以溶于有機溶劑，應用適當濃度的有機溶劑 (如乙醇)使DNA呈絮狀

10、沉淀析出（本實驗加入酒精后使食鹽濃度接近0.14mol/L）。在溶液中，DNA鏈略帶負電荷，而鹽離子可被吸引到DNA的負電荷上，中和這些負電荷，因此就能夠使DNA片段聚合在一起，形成絮狀粘稠物質。利用這一原理，就可以用酒精萃取DNA。 DNA與二苯胺作用生成藍色沉淀用來鑒定 DNA。二. 材料：洋蔥、洗潔精、食鹽、95酒精、蒸餾水、0.015 molL的NaCl溶液：稱取0.88g NaCl，投入1000ml容量瓶中，加水到所需體積的刻度線上，溶解后成0.015 molL氯化鈉溶液。二苯胺試劑：1 g重結晶的二苯胺溶于100ml冰乙酸（A.R.）中，再加10ml過氯酸，臨用前加入1.0ml 1

11、6%的乙醛，試劑應為無色，三.器具：勻漿機或研缽、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒、滴管、試管、天平。四.方法步驟 稱取100 g洋蔥，切碎，放進攪拌機或研缽中 加入100ml洗潔精充分攪拌或研磨將研磨液用漏斗和兩層紗布過濾到燒杯中加入1g食鹽，攪拌均勻量取上述澄清的洋蔥液50ml加入70ml的95酒精輕輕搖動或用玻璃棒輕輕攪拌白色纖維狀粘稠物質析出，即DNA用玻璃棒可將其輕輕卷起，放入1號試管攪拌溶解后，加入4ml二苯胺試劑混合均勻，在沸水浴中加熱 38min，觀察顏色的變化。五. 實驗注意事項1)材料必須充分勻漿或研磨，否則洋蔥細胞沒有完全破碎，影響實驗效果；2)加入酒精后搖動或攪拌時一定要

12、輕緩，否則會破壞DNA，以至于看不到；3)DNA鑒定時，二苯胺最好現配現用，否則二苯胺會變成淺藍色或綠色，則不能使用。4 幾種新材料的DNA粗提取介紹4.1 細菌DNA提取方法（尤其對有莢膜的細菌）方法一1種子加入2ml盛有4預冷的抽提緩沖液（8M LiCl，2% b-巰基乙醇僅針對RNA）離心管中，4過夜； 2離心4s，轉移上清到2ml新管中（針對植物）； 3離心，12,000rpm，30min，4（僅針對RNA）； 4棄上清液，用70乙醇洗沉淀，風干； 5溶解上述沉淀于緩沖液（5%SDS，10mMNaCl，25mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH7.6，2巰基乙醇）中； 6加入

13、等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）7離心12,000rpm，10min，轉移上清到新管中. 8加入等體積氯仿/異戊醇(24：1) 9離心12,000rpm，10min，轉移上清到新管中10分裝至兩支1.5ml離心管中，各加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），200C沉淀； 11離心12,000rpm，10min； 12. 棄上清，70乙醇洗，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。方法二1試劑：抽提緩沖液、2% CTAB (W/V)、 2% PVP K25 (w/v) （去色素）、100mM Tris-HCl (pH8.0)、 25mM

14、EDTA (pH8.0)、 2.0M NaClbM.、 2.10M LiClr+1、3. 2M LiCl, DEPC-water（抑制RNA酶活性）、 3M NaAc (pH5.2) 、96% 乙醇、 70% 乙醇2步驟：1）抽提緩沖液65預熱；2） 加菌體到已經預熱的緩沖液（700ul）中混勻，65，10min；; 3）加酚、氯仿、異戊醇（25：24：1），振蕩，離心12,000rpm，10min；4）取上清，加氯仿、異戊醇（24：1）振蕩，離心12,000rpm，10min； 5）取上清，重復4步驟；6）加10M LiCl 1/4體積到上清液；7）4過夜，沉淀DNA；8）離心（12,000

15、rpm，10min），棄上清；9）70乙醇洗，再用100乙醇洗，風干；10） 加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），200C沉淀；11）離心12,000rpm，10min；12）棄上清，70乙醇洗，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。 4.2 從動物組織提取DNA的方法： 一、材料：哺乳動物新鮮組織。 二、設備： 移液管、高速冷凍離心機、臺式離心機、水浴鍋。 三、試劑 1、分離緩沖液：10mmol/L TrisCl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/

16、ml或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步驟:1. 切取組織5g左右,剔除結締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細越好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。 3. 加1ml 10% SDS, 混勻,此時樣品變得很粘稠。 4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37保溫1-2小時, 直到組織完全解體。 5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數秒鐘。 6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心

17、 5分鐘。7. 取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風情況下操作)。 8. 移去上層乙醚,保留下層水相。 9. 加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。 10. 用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。 11. 如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5l RNaseA(10g/l), 37保溫30分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10重沉淀DNA。4.3 大豆DNA的提取將新鮮大豆葉片

18、保存在冰箱，用時取出。1、稱取大豆葉片2克左右，放入研磨缽中，倒入液氮，將其研碎成粉末。2、將粉末裝入50ml離心管中；同時將CTAB提取液放入水浴鍋中，加溫至65度。3、吸取10ml的CTAB提取液和200ul的巰基乙醇放入裝有葉片粉末的離心管中。4、充分振蕩后，放入65度的水浴鍋中，大約40分鐘；其間，每隔10分鐘輕輕的搖晃離心管，使溶液和粉末充分混合。5、40分鐘后，取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇（24：1），充分混勻。6、然后將離心管放入離心機中離心，轉速12000rpm，時間大概15分鐘，即可。7、取上清液至另一離心管中，再吸取等體積的氯仿異戊醇，混勻離心，重復上述步驟。8、

19、再一次吸取上清液，加入2倍于該上清液體積的冰無水乙醇，輕輕混勻（因為此時DNA已有少許絮狀沉淀，避免DNA斷裂），放入4度冰箱中，大概1小時左右。9、將DNA沉淀用玻璃器皿將其挑到1.5ml的離心管中，用70%的酒精清洗兩遍，放置室溫中，待其酒精味揮發完之后（用鼻子聞聞），加入TE溶液即可，這就是DNA原液，放入-20度冰箱保存即可。4.4 植物DNA的SDS（十二烷基硫酸鈉）提取法：取2-3g新鮮葉片，在液氮中研磨成粉狀（防止溶化）后轉入15ml離心管中。加入5ml于65預熱的提取緩沖液，65水浴保溫30min（搖動數次），使提取液與樣品充分混合。加入2ml 5mol/L Kac，劇烈振蕩，

20、冰浴保溫20 min以上。2700轉離心20min，將上清液倒入新的15ml離心管中，（若提取DNA用于Southern等實驗，一般在轉移上清時加濾膜，防止樣品殘渣混入，可保證DNA純度）。加入4ml氯仿/異戊醇（241），搖勻，平衡，2700轉離心15 min。在另一新的15ml離心管中加入5ml預冷的異丙醇，將上清液用移液槍轉入此管，在20冷卻30 min以上。2700轉離心10 min，棄去上清液，用4ml 70%乙醇洗滌，室溫保持10 min。2700轉離心3 min，倒去上清液。重復步驟7，用4ml 70%乙醇洗滌，室溫保持10 min。2700轉離心3min，倒去上清液。超凈工作臺

21、內吹干（3h左右）。加1ml TE緩沖液中溶解，加10l RNase （10mg/ml），在37恒溫箱中溫育20min。再加100l 3 mol/L NaAc和2ml無水乙醇，2700轉離心3min，倒去上清液。超凈工作臺內吹干（3h左右）。將DNA沉淀溶于150l TE中，置于超凈工作臺內（3h左右）。將TE溶液轉入已滅菌的15ml eppendorf管中,20保存備用。4.5 植物DNA的“一管法”提取方法：稱取100mg新鮮植物組織，剪碎置于15ml離心管中，可加入少許無菌石英砂，加入3滴提取緩沖液，用帶玻璃鉆頭的電鉆充分研磨勻漿。加入400l提取緩沖液，混勻后置于90水浴中，不時顛倒搖

22、勻。溫育20min后，置于冰浴中5min，使組織和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）沉淀，置于4下保存備用。4.6 適用于PCR研究的快速提取法：田間剪取植株新鮮葉片510mg（約2cm長）左右，新鮮葉片放于15ml離心管中，存于冰盒中，根據樣品號貼上相應的標簽。用剪刀將葉片組織剪細（約0.5cm長）放在點穴式研板中。加入400l DNA提取緩沖液，用玻棒將葉組織研細，直到液體變成深綠色即可。再加400l DNA提取緩沖液，混合均勻，轉入一新的15ml離心管（貼上相應的編號）。加400l氯仿，混合均勻后，2400轉離心30s，將上清液轉入一支新的15ml離心管（貼上相應的編號）。加800l無水乙醇，

23、混勻，2400轉離心3min。棄上清。70%乙醇沖洗，風干。用50l TE緩沖液溶解，存于20。取1l用于PCR分析。4.7 棉花等酚類、多糖類物質較多的植物DNA提取法：取2g新鮮幼嫩的葉片放入研缽中，加入液氮后快速、充分研磨，待成極細的粉末狀時迅速轉入到50ml離心管中。在50ml離心管中加入10ml冰預冷的提取緩沖液，在渦懸振蕩器上充分混勻。于4，2700轉離心20min，倒去上清液在沉淀中加入5ml裂解緩沖液，在渦旋振蕩器上充分混勻。于65水浴鍋中溫育30min。加入5ml氯仿/異戊醇（24/1），并上下翻轉以充分混合。于4，2700轉離心5min。轉移上層水相至一新的50ml離心管中

24、。重復步驟79一次。加入2/3體積的冰預冷的異丙醇，并上下翻轉以充分混合，至20 2h。于4，1200轉離心10min。在一新管中加入20ml含80%乙醇15m mol/L NaAc溶液，用玻棒將DNA轉入該管（如不能直接用玻棒纏出，可離心后倒出上清，再在其中加入20ml含80%乙醇15m mol/L NaAc溶液），放置20min后稍許離心，移走上清并吸出殘存乙醇，室溫干燥。加入1 0ml TE（10 m mol/L Tris-HCl pH=8.0、1 m mol/L EDTA）并加入終濃度為20g/L的RnaseA，過夜。風干，用50l TE緩沖液溶解，存于20備用。 4.8 植物DNA的

25、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取法：稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。將粉末轉移到的加有7ml經預熱的15CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻后置于65水浴中，溫育30min。取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿、異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉離心20min。將上清轉移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300轉離心20min。轉移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉淀緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉淀。1000轉離心10min，使DNA沉淀于管底。加入1.5-2

26、ml的1mol/L NaCl及5l RNase置于56水浴中過夜。待DNA完全溶解后，加2-3ml 4預冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml離心管中。用70%乙醇清洗30min，用離心機甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作臺上吹干。將風干的DNA直接在4保存備用或溶于100l TE溶液中于-20保存。5 二苯胺試劑的配制A液：15 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL濃硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結晶狀態,則需加溫后待其熔化,再使用。B液：乙醛的體積分數為0.2%的溶液。將0.1 mL B液加入到10 mLA液中,現

27、配現用。6 研磨液的配制方法Tris（三羥甲基氨基甲烷）：10.1 g(相對分子質量為121.14),先加50 mL 蒸餾水溶解,用物質的量濃度為2 moL/L 的鹽酸調至pH8.0,再加下述藥品。NaCl：8.76 g(相對分子質量58.44)EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：37.2 g(相對分子質量372.24)SDS(十二烷基磺酸鈉)：20 g(相對分子質量288.3)待上述藥品全部溶解后,再用蒸餾水定容至1 000 mL。若在室溫低于20 時配制藥液,SDS呈沉淀析出,此時需要加溫,才能將SDS溶解。如果提前配制的研磨液出現了沉淀,則應加溫使沉淀溶解后再使用。7 研磨液中幾種藥品的作用S

28、DS(十二烷基磺酸鈉):可使蛋白質變性,與DNA分離。 EDTA(乙二胺四乙酸二鈉):為DNA酶的抑制劑,可以防止細胞破碎后DNA酶降解DNA。物質的量濃度為0.15 moL/L的氯化鈉溶液：能很好地溶解DNA。Tris/HCl：提供緩沖體系,DNA在此緩沖體系中呈穩定狀態。(Tris為三羥甲基氨基甲烷)8鑒定DNA的其他方法用紫外燈照射法鑒定DNA效果很好。具體鑒定方法如下。 1.配制染色劑。用蒸餾水配制萬分之五的溴化乙錠(EB)溶液。2.將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟紙上,再滴1滴EB溶液染色。3.將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中),可見橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在

29、280 nm處)。9 淺談DNA的粗提取和鑒定實驗的設計思路遵循實驗步驟提取和鑒定DNA，從而掌握“怎樣做”的方法十分重要。但親身體驗科學過程，培養“為什么要這樣做”的思維習慣，使學生改變學習方式而主動學習就更為重要。下面就談一談該實驗的設計思路。一、問題來源及連鎖目標粗提取并進一步提純DNA，從而單獨地、直接地去觀察DNA的作用，對于驗證DNA是遺傳物質十分關鍵。同時，能使學生在對提取出的DNA進行物理觀察的過程中直觀認識DNA絮狀聚集物。二、問題延伸及子問題展現要提取DNA并鑒定提取物是DNA，遞次出現的問題有：DNA主要存在于細胞核中，如何選取具核的生物組織作為實驗材料。如何除去核外的核

30、膜和質膜，對于植物細胞又如何破壁。細胞核中除DNA外，還有RNA，且DNA以核蛋白體DNP的形式存在。那么，如何使DNA和RNA分開，又如何使DNA和蛋白質分開。如何去除雜質物質使DNA更加純化。如何驗證提取物主要是DNA成分。三、問題分析及處理方案對以上子問題進行相應的分析和處理：取雞血細胞液（其紅細胞橢圓具核，除駱駝外，豬、羊、狗等哺乳動物紅細胞無核）當然，在提取出的DNA中也含有一定量的胞質DNA，即線粒體DNA和葉綠體DNA。使紅細胞溶血破膜。在低滲溶液中，如加蒸餾水使血細胞過度滲透吸水直至破裂，同時用玻棒加速血細胞及核破裂，經一級過濾后濾出液為DNA核蛋白和RNA核蛋白。利用DNA和

31、RNA溶解度的不同析出DNA。在濃氯化鈉溶液（2 mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，而RNA核蛋白的溶解度很小。在稀氯化鈉溶液（0.14molL）中DNA的溶解度最低，蛋白質的溶解度很高而出現鹽溶現象，經二級過濾后濾出液主要為DNA粗制品。DNA不溶于酒精，經三級過濾后，再利用乙醇沉淀法使其他物質溶于酒精而進一步純化DNA。二苯胺鑒定法即DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成藍色，且顏色的深淺與DNA純化程度有關。在此過程中設計對照實驗，以增強實驗中二苯胺對DNA專一性顯色結果的可信度。四、評價總結及批判性研究就DNA粗提取和鑒定實驗的結果而言，它是一個定量分析定性檢測實驗。其生化實驗的復雜性

32、決定了學生必須對該實驗的操作要點和具體步驟作出必要的歸納總結，才能對實驗流程作一個整體把握。就該實驗的過程而言，大有文章可作。應鼓勵學生積極開拓思維，從不同的研究角度大膽地進行創新研究，在評判諸如選材的優劣、操作的繁簡以及實驗的改進等方面問題的過程中，愉快而輕松地學習。1個目的：在體驗科學思維的過程中提取和鑒定DNA。2次用蒸餾水：蒸餾水破膜提取核物質和蒸餾水稀釋析出DNA。3次過濾：過濾核外物質，過濾DNA核蛋白，過濾DNA。4個關鍵詞：DNA提取，設計思路，科學思維和研究性學習。5次攪拌：第1步同方向加力攪拌，第3、5步同方向輕緩攪拌，第7步同方向緩慢攪拌，第8步可不同方向攪拌。6種溶液：

33、主要有檸檬酸鈉液、酒精液、二苯胺液、甲基綠液、0.015 molL和2 molL氯化鈉液。7種探究模式：本實驗可嘗試性拓展為探究性實驗，改型后主要參考課題有（a）探究使用雞的不同組織材料進行實驗時的實驗效果。（b）探究蒸餾水量引起的雞血細胞在不同低滲狀態下的破裂程度。（c）探究 DNA在不同質量分數氯化鈉溶液中的溶解度并繪出曲線圖。(d）探究DNA鑒定過程中不同水浴溫度對顯色的影響。（e）探究沉淀DNA時不同溫度的酒精對沉淀量的影響。（f）探究過濾過程中紗布層數對最終提取物量的影響。(g）探究使用玻璃燒杯、試管與使用塑料制品對DNA提取量的影響。8個步驟：提取過濾溶解過濾再溶解再過濾提純鑒定。10 DNA粗提取和鑒定的記憶本實驗是考綱當中步驟最為復雜的，記憶成為一個難題，思得一法，試行之。一、結合原理對應步驟記憶，將實驗分為以下三大步。 1、DNA在0.14mol/L