谷氨酸發酵機制以及雜菌噬菌體防治

谷氨酸發酵機制,一、谷氨酸合成途徑二、葡萄糖發酵谷氨酸的理想途徑三、細胞膜通透性的調節四、谷氨酸生產菌的特征和種類,一、谷氨酸合成途徑,糖酵解途徑（EMP途徑） 磷酸戊糖途徑（HMP途徑）三羧酸循環乙醛酸循環丙酮酸羧化支路（CO2固定反應）,谷氨酸發酵的代謝途徑,生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脫氫酶系的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，另一部分經CO2固定反應生成草酰乙酸或蘋果酸.草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進入三羧酸循環，檸檬酸在順烏頭酸酶的作用下生成異檸檬酸，異檸檬酸再在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成-酮戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前體。-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶作用下經還原氨基化反應生成谷氨酸,谷氨酸,脫氫酶,合成酶,Glc,丙酮酸,草酰乙酸,CO2,天冬氨酸（Asp）,乙酰-coA,CO2,羧化酶,檸檬酸,順烏頭酸,異檸檬酸,-酮戊二酸,Glu,反饋抑制,異檸檬酸,脫氫酶,反饋阻遏,優先合成,谷氨酸生物合成調節機制,-酮戊二酸脫氫酶,優先合成 谷氨酸比天冬氨酸優先合成，谷氨酸合成過量后，就會抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉向合成天冬氨酸檸檬酸合成酶的調節 檸檬酸合成酶是三羧酸循環的關鍵酶，除受能荷調節外，還受谷氨酸的反饋阻遏和順烏頭酸的反饋抑制，谷氨酸合成過量時，代謝轉向天冬氨酸的合成。,優先合成與反饋調節,-酮戊二酸脫氫酶的調節在谷氨酸產生菌中，-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，使-酮戊二酸不能繼續氧化。谷氨酸脫氫酶的調節 谷氨酸對谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋阻遏 -酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強，故優先合成谷氨酸,控制谷氨酸合成的重要措施,丙酮酸羧化酶,檸檬酸合成酶作用生成檸檬酸,乙醛酸循環基本不發生,一檸檬酸脫氫酶作用,-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱,谷氨酸脫氫酶能力強,細胞膜通透性強,（1）葡萄糖經過EMP和HMP生成丙酮酸，以EMP途徑為主，生物素充足時HMP占38%，亞適量為26%.(2) 生成的丙酮酸在脫氫酶系作用下生成乙酰輔酶A，另一部分生成草酰乙酸或蘋果酸。（3）草酰乙酸和乙酰輔酶A在檸檬酸合成酶作用下生成檸檬酸，然后再順烏頭酸酶作用下生成異檸檬酸，再在異檸檬酸脫氫酶作用下生成-酮戊二酸?？刂乒劝彼岷铣傻闹匾胧?1、-酮戊二酸氧化能力弱 2、谷氨酸脫氫酶活性強 3、細胞膜對谷氨酸通透性高,二、細胞膜通透性的調節,對谷氨酸發酵的重要性：當細胞膜轉變為有利于谷氨酸向膜外滲透的方式，谷氨酸才能不斷地排出細胞外，這樣既有利于細胞內谷氨酸合成反應的優先性、連續性，也有利于谷氨酸在胞外的積累。,細胞膜是在細胞壁與細胞質之間的一層柔軟而富有彈性的半滲透性膜，磷脂雙分子層為其基本結構，在雙分子層中鑲嵌蛋白質。,一種是通過控制脂肪酸和甘油的合成，實現對磷脂合成的控制，使得細胞不能形成完整的細胞膜；一種是通過干擾細菌細胞壁的形成，使得細胞不能形成完整的細胞壁，喪失了對細胞膜的保護作用。在膜內外滲透壓差等因素影響下，細胞膜物理性損傷，增大膜的通透性。,根據細胞膜的結構特性，控制細胞膜通透性的方法主要有兩種：,1控制細胞膜的形成,1、利用生物素缺陷型菌株進行谷氨酸發酵時，限制發酵培養基中生物素的濃度。生物素是催化脂肪酸合成起始反應的關鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，對脂肪酸的形成起促進作用，進而影響了磷脂的合成和細胞膜的形成。選育生物素缺陷型菌株，阻斷生物素合成，亞適量控制生物素添加，抑制不飽和脂肪酸的合成，使得細胞膜不完整，提高了細胞膜對谷氨酸的通透性。,2、利用生物素過量的糖蜜原料進行谷氨酸發酵時，添加表面活性劑或飽和脂肪酸。 在生物素過量的條件下，添加表面活性劑或飽和脂肪酸仍能進行谷氨酸發酵，其原因在于這些物質對生物素起拮抗作用，抑制不飽和脂肪酸的合成，導致油酸合成量減少，磷脂合成不足，使得細胞膜不完整，提高了細胞膜對谷氨酸的通透性。常用的表面活性劑有吐溫-60、吐溫-40等。常用的飽和脂肪酸有十七烷酸、硬脂酸等。,3、利用油酸缺陷型菌株進行谷氨酸發酵，限制發酵培養基油酸的濃度。 油酸缺陷型菌株喪失了自身合成油酸的能力，直接影響磷脂的合成，不能形成完整細胞膜，必須添加油酸才能生長，所以通過控制油酸的添加量，實現細胞膜對谷氨酸的通透性。 當油酸過量時，該菌株只長菌或產酸少；當油酸亞適量時，隨著油酸的耗盡，細胞膜結構與功能發生變化，使得谷氨酸的通透性提高。,一種脂肪酸。分子式C18H34O2,甘油缺陷型菌株不能自身合成磷酸甘油和磷脂，外界供給甘油才能使其生長，因此可以通過控制甘油添加量來控制細胞膜對谷氨酸的通透性。 當甘油添加量過多時，磷脂正常合成，菌體正常生長，不產酸或產酸低； 當甘油添加量過少時，菌體生長不好，產酸低，所以控制甘油亞適量是控制的關鍵。,4、利用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發酵，限制發酵培養基甘油的濃度。,5、利用溫度敏感突變株控制細胞膜的生物合成,溫度敏感突變株的突變位置是發生在決定與谷氨酸分泌有密切關系的細胞膜結構的基因上，發生堿基的轉換或顛換，一個堿基為另一個堿基所置換。這樣，該基因所指導譯出的酶只能在一定溫度下有合成完整細胞膜的活性；提高溫度此酶就失活，導致細胞膜某些結構改變。,2控制細胞壁的形成,細胞壁的骨架結構是肽聚糖。對細胞壁形成的控制方法：添加青霉素、頭孢霉素C等-內酰胺類抗生素。,雙糖單位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）,青霉素是糖肽末端結構(D-Ala-D-Ala)的類似物，與轉肽酶的活性中心結合，使轉肽酶受到了不可逆的抑制，糖肽合成不能完成，結果形成不完整的細胞壁，使細胞膜處于無保護狀態，易于破損，增大谷氨酸的通透性。,轉肽酶功能：在蛋白質生物合成過程中肽鍵的形成具有必須的作用。轉肽酶識別特異多肽,催化不同的轉肽反應。,青霉素控制細胞壁形成的原因：,由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑：A？B？,谷氨酸生物合成的理想途徑,三、葡萄糖發酵谷氨酸的理想途徑,1、當通過CO2固定反應供給四碳二羧酸時，葡萄糖的理論轉化率為,1分子葡萄糖1分子谷氨酸,由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的總反應方程式為：C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2 + 3H2O,1mol葡萄糖1mol谷氨酸，因此理論糖酸轉化率為81.7%。,若CO2固定反應完全不起作用，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的催化作用下，脫氫脫酸全部氧化成乙酰CoA，通過乙醛酸循環供給四碳二羧酸，則反應如下：1mol 葡萄糖2乙酰CoA 四碳二羧酸0.5 mol 葡萄糖乙酰CoA 由于3葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，因此理論糖酸轉化率僅為54.4%。實際糖酸轉化率處于54.4%和81.7%之間。,2、當通過乙醛酸循環供給四碳二羧酸時,1mol Glu,噬菌體與雜菌的防治,一、什么是噬菌體二、谷氨酸發酵中噬菌體的污染三、防治噬菌體對谷氨酸發酵的污染四、染菌隱患的檢查和處理五、染菌的預防措施,目錄,什么是噬菌體,噬菌體是侵染細菌、放線菌等微生物并使細胞裂解死亡的一類病毒。噬菌體對理化因素抵抗力強，且寄生性具有高度特異性專一性，一種噬菌體往往只侵染一種或某一菌株,谷氨酸發酵中噬菌體的污染,噬菌體污染發酵液以后的情況，因為發酵工業的種類、污染噬菌體的特性、感染時間、培養基成分、發酵罐內物理和化學條件等不同而異，即同樣的噬菌體不一定引起同樣的異常發酵情況,（一）噬菌體污染的異常情況,由于污染時間和感染數量不同，以及噬菌體毒力差異表現的癥狀不一，但一般有”二高三低“即pH高、殘糖高、OD值低、溫度低、谷氨酸產量低。具體表現如下：1、二級種子污染噬菌體：OD值不長、pH上升、泡沫大、耗糖慢、不產酸等電信的噬菌體污染現象。2、發酵前期污染噬菌體：吸光度先升后降、不升或回降pH升到8以上且不下降，OD值下跌耗糖慢。產生大量泡沫粘度增大發酵液發紅發灰，有刺激性氣味，氨基酸產量少或不產,鏡檢時發現菌體數量顯著減少具體不規則革蘭士染色有紅色碎片。平板有噬菌斑。發酵周期變長，生物素需求變大。精制中和時色素深泡沫大堿液加不進去。3、發酵后期污染噬菌體：對產酸影響不大有時還能提高產酸。但也不能忽視，因為不僅會使難于過濾且污染會前移造成更大污染,三、防治噬菌體對谷氨酸發酵的污染,1、合理使用抗性菌株：使用對噬菌體不敏感的菌株，也可以輪換使用對噬菌體敏感性弱的菌株。2、利用藥物防治噬菌體：現在使用的藥物分為兩類：一是阻止噬菌體吸附的藥物，多為螯合劑；另一類是抑制噬菌體蛋白質合成或阻斷其復制的藥物，多為抗生素。此外還有用染料、抗壞血酸雜蒽累等藥物。但不能對人體有害。,3、采取以環境凈化為中心的綜合防治措施：如定期檢查包括空氣在內的環境中的噬菌體；嚴禁活菌體任意排放，凡是污染噬菌體的發酵液、洗罐水等都要加熱到80C以上，發酵罐拍的氣體都要與蒸汽或堿液、漂白粉充分混合；滅殺環境中的噬菌體；滅殺壓縮空氣中的噬菌體；避免噬菌體侵染菌株；避免噬菌體侵入設備4、污染噬菌體的挽救措施：并罐法、菌株輪換活使用抗性菌株、放罐重消法、罐內滅噬菌體法,四、染菌隱患的檢查和處理,（一）染菌檢查 ：檢查凈化空氣、檢查培養基和培養物、檢查發酵罐、檢查罐道的污染隱患、檢查無法直接觀察的設備部件雜菌污染,（二）染菌處理 1、前期出現染菌：輕度時降低溫度，降低pH，補加適量的菌種等確立生產菌的生長優勢 。嚴重時糖分高則實施實罐滅菌低則補加培養液，無法挽救則倒罐。2、中期染菌：降低通風量溫度，停止攪拌補加糖3、后期染菌：輕度染菌則可以讓其發酵完，可以適當提前放罐；重度染菌則立即放罐，并且度空罐進行清洗滅菌,五、染菌的預防措施,（一）空氣的凈化：減少過濾前空氣的塵埃、賈少過濾前