Racl與NF-κB p65表達：解鎖非小細胞肺癌轉移與預后密碼

Racl與NF-κBp65表達：解鎖非小細胞肺癌轉移與預后密碼一、引言1.1研究背景與意義1.1.1非小細胞肺癌現狀肺癌是全球范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。其中，非小細胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）占據了所有肺癌病例的大約85%，是最為常見的肺癌類型。據相關統計，男性的非小細胞肺癌發病率大概在十萬分之五十左右，女性接近十萬分之三十，在國內肺癌的發病率居于首位，2018年的數據顯示，肺癌新發病率占所有腫瘤新發病例的18%。盡管當前針對非小細胞肺癌的治療手段，如手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等不斷發展，但患者的總體預后仍然不容樂觀，五年生存率仍然不足20%。轉移是導致非小細胞肺癌患者死亡的關鍵因素之一，一旦發生轉移，患者的治療難度大幅增加，生存時間顯著縮短。例如，非小細胞肺癌腦轉移屬于遠處轉移，此時腫瘤已進展到晚期，治療難度極大，患者中位生存期僅8-10個月，1年生存期為30%-35%，2年生存期只有10%-15%。不同分期的非小細胞肺癌患者5年生存率差異明顯，Ⅰ期患者5年生存率約為70%，Ⅱ期約為50%，ⅢA期約為30%，而ⅢB期能手術切除者5年生存率大概在15-30%，不能手術切除者與Ⅳ期相同，僅有5-10%，Ⅳ期患者因已發生淋巴結和遠處轉移，無法手術切除，單純放、化療的5年生存率更是不到10%。因此，深入研究非小細胞肺癌的轉移機制，尋找有效的預后評估指標和治療靶點，對于改善患者的生存狀況、提高生存率具有極其重要的緊迫性和現實意義。1.1.2Racl和NF-κBp65研究意義Racl屬于RhoGTP酶家族的重要成員，在細胞極性、運動和轉移等過程中發揮著關鍵作用。已有研究表明，Racl在非小細胞肺癌細胞中的表達水平明顯升高，并且與腫瘤的浸潤和遠處轉移密切相關，它能夠誘導腫瘤細胞從原位“跳”到遠處，促進腫瘤的遷移和侵襲，被視為非小細胞肺癌腫瘤轉移的重要促進因素。NF-κBp65是轉錄因子NF-κB家族的一個亞單位，可激活眾多與腫瘤發生相關的基因。研究發現，NF-κBp65在非小細胞肺癌組織和細胞中的表達水平也顯著升高，與腫瘤的侵襲和遠程轉移緊密相連。它不僅可以促進腫瘤細胞從原位轉移，還能抵抗化療藥物的作用，同時促進腫瘤微環境的形成，提高腫瘤細胞的存活能力，進一步推動了腫瘤的侵襲和轉移。鑒于Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌轉移過程中的重要作用，對它們與非小細胞肺癌轉移和預后的相關性進行深入研究，有望為非小細胞肺癌的診斷、治療和預后評估提供新的分子標志物和潛在治療靶點。通過檢測它們的表達水平，或許能夠更準確地預測患者的轉移風險和預后情況，為臨床醫生制定個性化的治療方案提供有力依據，從而提高治療效果，改善患者的生存質量和延長生存期，對非小細胞肺癌的臨床治療和患者生存具有重要的潛在價值。1.2國內外研究現狀在國外，關于Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌中的研究開展較早且較為深入。早在2000年，就有學者通過細胞實驗發現Racl在非小細胞肺癌細胞系中的表達異常升高，并且干擾Racl的表達能夠顯著抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力，首次揭示了Racl與非小細胞肺癌轉移之間的潛在關聯。隨后，一系列研究從分子機制層面進行探索，發現Racl可以通過激活下游的WASP-Arp23復合物，促進肌動蛋白的聚合，從而改變細胞骨架的結構，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供動力。在NF-κBp65方面，國外研究人員利用基因敲除技術，在小鼠非小細胞肺癌模型中證實了NF-κBp65基因缺失后，腫瘤的生長和轉移明顯受到抑制，同時腫瘤組織中與轉移相關的蛋白如MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）等表達顯著降低，揭示了NF-κBp65在調控非小細胞肺癌轉移相關基因表達中的關鍵作用。此外，還有研究通過對大量非小細胞肺癌患者的臨床樣本分析，發現NF-κBp65的高表達與患者的不良預后密切相關，高表達組患者的五年生存率明顯低于低表達組。國內對Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌中的研究也取得了諸多成果。有研究團隊運用免疫組織化學和Westernblot等技術，對不同分期的非小細胞肺癌組織進行檢測，發現Racl和NF-κBp65的表達水平均隨著腫瘤分期的升高而顯著增加，且兩者的表達呈正相關關系。進一步的體外實驗表明，抑制Racl的活性可以下調NF-κBp65的磷酸化水平，進而抑制其核轉位和轉錄活性，減少相關促轉移基因的表達，提示Racl可能通過調控NF-κBp65信號通路來影響非小細胞肺癌的轉移。在臨床應用探索方面，國內有學者嘗試將Racl和NF-κBp65作為聯合診斷指標，對非小細胞肺癌患者的病情進行評估，發現兩者聯合檢測的靈敏度和特異度均高于單獨檢測，為臨床早期診斷和病情監測提供了新的思路。盡管國內外在Racl和NF-κBp65與非小細胞肺癌轉移及預后關系的研究上已取得了一定進展，但仍存在一些不足之處。目前的研究多集中在細胞和動物模型層面，臨床大樣本、多中心的研究相對較少，導致研究結果的普遍性和可靠性受到一定限制。此外，雖然已知Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌轉移中發揮重要作用，但它們之間具體的相互作用機制以及與其他信號通路之間的交叉調控網絡尚未完全明確。在預后評估方面，現有的研究多是將兩者分別與預后指標進行關聯分析，缺乏對兩者聯合作為預后評估指標的系統研究，難以全面、準確地預測患者的預后情況。本研究將在現有研究基礎上，通過收集大量非小細胞肺癌患者的臨床標本，采用免疫組織化學、蛋白質印跡等多種技術，深入探討Racl和NF-κBp65的表達與非小細胞肺癌轉移及預后的關系，并進一步研究兩者之間的相互作用機制，以期為非小細胞肺癌的臨床診斷、治療和預后評估提供更為全面、準確的理論依據和實踐指導。1.3研究目的與方法1.3.1研究目的本研究旨在深入探討Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌組織中的表達情況，明確它們與非小細胞肺癌轉移及預后之間的具體關系。通過檢測不同轉移狀態和預后情況的非小細胞肺癌患者組織中Racl和NF-κBp65的表達水平，分析其表達差異與腫瘤轉移、患者生存期等臨床指標的相關性，從而為非小細胞肺癌的臨床診斷提供新的潛在分子標志物，幫助醫生更準確地判斷患者的病情和轉移風險。同時，研究兩者在非小細胞肺癌轉移過程中的作用機制，探索以Racl和NF-κBp65為靶點的治療策略，為非小細胞肺癌的治療提供新的思路和方法，最終改善患者的預后，提高生存率。1.3.2研究方法本研究將通過多種實驗方法和統計學分析手段來深入探究Racl和NF-κBp65與非小細胞肺癌轉移及預后的關系。在實驗方法上，首先進行病例采集，選取某一時間段內在特定醫院接受手術治療的非小細胞肺癌患者的組織標本，同時收集正常肺組織標本作為對照。根據患者的腫瘤是否發生轉移，將非小細胞肺癌組織標本分為轉移組和非轉移組。接著運用免疫組織化學染色方法，對收集的組織標本進行處理，使用特異性抗體分別標記Racl和NF-κBp65蛋白，通過顯微鏡觀察并分析它們在不同組織中的表達定位和表達強度。蛋白質印跡分析也是重要的實驗方法之一，提取組織中的總蛋白，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，再將其轉移到固相膜上，用特異性抗體檢測Racl和NF-κBp65蛋白的表達水平，以半定量的方式準確評估它們在肺癌組織和正常肺組織中的表達差異。在統計學分析方面，采用SPSS等專業統計軟件對實驗數據進行處理。對于兩組之間的比較，使用獨立樣本t檢驗；多組之間的比較則采用方差分析。分析Racl和NF-κBp65的表達水平與非小細胞肺癌患者的臨床病理特征，如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移等之間的相關性，采用Pearson相關分析或Spearman秩相關分析。運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，分析Racl和NF-κBp65的表達與患者生存時間的關系，并通過Log-rank檢驗進行組間比較。使用Cox風險比例模型進行多因素分析，篩選出影響非小細胞肺癌患者預后的獨立危險因素，綜合評估Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌轉移和預后中的作用。二、非小細胞肺癌概述2.1非小細胞肺癌的定義與分類非小細胞肺癌是肺癌中最為常見的類型，約占所有肺癌病例的85%。從定義上講，它是指除小細胞肺癌（SCLC）以外的所有肺癌類型，其癌細胞生長和擴散速度相對較慢，對化療和放療的敏感性也低于小細胞肺癌。非小細胞肺癌涵蓋多種病理類型，主要包括腺癌、鱗癌和大細胞癌等，不同類型具有各自獨特的特點。腺癌是最常見的非小細胞肺癌亞型，在肺癌中的占比約為40%。女性腺癌患者相對多見，主要起源于支氣管黏液腺，可發生于細小支氣管或中央氣道。根據組織學特征，腺癌又可細分為5個亞型，其中附壁型（CT表現為磨玻璃結節）惡性程度相對較低，實體型和微乳頭型（CT表現為實性結節）惡性程度較高。在分子特征方面，腺癌患者常伴有一些特定的基因突變，如EGFR、ALK等，這些突變與靶向治療的選擇密切相關，醫生會根據腫瘤基因檢測結果，決定患者適合接受靶向藥物治療還是化療。鱗癌在非小細胞肺癌中也占有一定比例，常見于老年男性。它一般生長較為緩慢，轉移相對較晚，這使得手術切除的機會相對較多，5年生存率在非小細胞肺癌各亞型中相對較高。不過，鱗癌對化療和放療的敏感性不如小細胞肺癌。鱗癌主要起源于較大的支氣管，常表現為中央型肺癌，在顯微鏡下可見癌細胞具有角化珠和細胞間橋等特征。大細胞癌是一種未分化的非小細胞癌，較為少見，在肺癌中的占比通常在10%以下。其在細胞學和組織結構及免疫表型等方面缺乏小細胞癌、腺癌或鱗癌的典型特征。大細胞癌的轉移相對較晚，手術切除機會相對較大。大細胞癌的癌細胞體積較大，細胞核大且形態多樣，細胞質豐富，惡性程度較高。除了上述主要類型外，非小細胞肺癌還包括腺鱗癌、肉瘤樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、NUT癌、唾液腺型癌等其他少見類型。這些少見類型各自具有獨特的病理特征和臨床行為，在診斷和治療上也具有一定的特殊性。例如，腺鱗癌同時具有腺癌和鱗癌的成分，其治療方案需要綜合考慮兩種癌的特點；肉瘤樣癌具有肉瘤的形態學特征，惡性程度高，預后較差。2.2非小細胞肺癌的發病率與死亡率非小細胞肺癌在全球范圍內呈現出較高的發病率和死亡率，嚴重威脅著人類的生命健康。從全球數據來看，肺癌是發病率位居第二、死亡率位居第一的癌種，在所有癌癥病例中，肺癌約占11.4%的新發病例，而因癌癥死亡的病例中，肺癌占比高達18%。在這其中，非小細胞肺癌又占據了肺癌病例的80-85%，是肺癌的主要構成部分。以2020年為例，全球新增肺癌病例約220萬例，死亡病例約180萬例，按照非小細胞肺癌的占比推算，當年新增非小細胞肺癌病例約176-187萬例，死亡病例約144-153萬例，數量極為龐大。在我國，非小細胞肺癌的形勢同樣嚴峻。肺癌在我國的發病率和死亡率均高居首位，發病率約為17.9%，死亡率達到23.8%，且均高于全球平均水平。2022年我國新發肺癌病例數約106萬，死亡人數高達74萬。這意味著，我國每年新增的非小細胞肺癌病例可能在84.8-90.1萬例左右，死亡病例約62.9-63.9萬例。從變化趨勢來看，過去幾十年間，我國非小細胞肺癌的發病率總體呈上升態勢，這與多種因素密切相關。隨著工業化和城市化進程的加速，空氣污染日益嚴重，汽車尾氣、工業廢氣等污染物的排放增加，為肺癌的發生埋下隱患。例如，在一些重工業城市，空氣中的PM2.5、苯并芘等有害物質含量較高，長期暴露在這樣的環境中，會增加患肺癌的風險。吸煙也是導致非小細胞肺癌發病率上升的重要因素，我國吸煙人數眾多，煙民數量超過3億，吸煙產生的尼古丁、焦油等有害物質會對肺部造成持續性損傷，進而引發肺癌。此外，人口老齡化程度的加深，使得患癌風險增加，也在一定程度上推動了非小細胞肺癌發病率的上升。在死亡率方面，盡管現代醫學在非小細胞肺癌的治療上取得了一定進展，如手術技術的改進、化療藥物的更新、靶向治療和免疫治療的出現等，但非小細胞肺癌患者的總體死亡率仍然居高不下。這主要是因為大部分患者在確診時已處于中晚期，腫瘤已經發生了局部浸潤或遠處轉移，錯過了最佳的手術治療時機。例如，約70%的患者在確診時已處于Ⅲ期或Ⅳ期，此時腫瘤細胞已經擴散到周圍組織或遠處器官，治療難度大幅增加。中晚期患者的五年生存率較低，Ⅲ期患者的五年生存率約為30%，Ⅳ期患者更是不到10%。即使接受了綜合治療，患者的復發率也較高，這進一步降低了患者的生存率。非小細胞肺癌對人類健康的嚴重威脅不容忽視，深入研究其發病機制、轉移規律以及有效的治療和預后評估方法迫在眉睫。二、非小細胞肺癌概述2.3非小細胞肺癌的治療現狀2.3.1傳統治療方法手術治療是早期非小細胞肺癌的重要治療手段，對于Ⅰ期和部分Ⅱ期患者，手術切除腫瘤是實現根治的主要途徑。手術方式包括肺葉切除、肺段切除和楔形切除等，醫生會根據腫瘤的位置、大小以及患者的身體狀況等因素選擇合適的手術方式。例如，對于位于肺周邊、直徑較小的腫瘤，楔形切除或肺段切除可能是較好的選擇，既能切除腫瘤，又能最大程度保留肺功能；而對于腫瘤較大或位置靠近中央的患者，可能需要進行肺葉切除。手術治療能夠直接去除腫瘤組織，早期患者通過手術切除后，五年生存率相對較高，Ⅰ期患者的五年生存率可達70%左右。然而，手術治療也存在一定局限性，對于中晚期患者，由于腫瘤可能已經侵犯周圍組織或發生轉移，手術切除難度大，且術后復發風險較高。部分患者由于身體狀況較差，如心肺功能不全等，無法耐受手術，也不能選擇手術治療。化療在非小細胞肺癌的治療中也占據重要地位，無論是早期患者術后的輔助化療，還是中晚期無法手術患者的主要治療手段，化療都能發揮作用。化療藥物通過抑制腫瘤細胞的DNA合成、干擾細胞分裂等方式來殺死腫瘤細胞。常用的化療藥物有鉑類（如順鉑、卡鉑）、紫杉類（如紫杉醇、多西他賽）、長春瑞濱、吉西他濱等。對于早期患者，術后輔助化療可以降低復發風險，提高生存率；對于晚期患者，化療可以控制腫瘤的生長和擴散，緩解癥狀，延長生存期。一項針對Ⅱ-Ⅲ期非小細胞肺癌患者的研究顯示，術后接受輔助化療的患者，五年生存率比未接受化療的患者提高了約5%-10%。化療也伴隨著諸多副作用，如惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等，這些副作用會嚴重影響患者的生活質量，部分患者可能因無法耐受副作用而中斷治療。而且，腫瘤細胞對化療藥物容易產生耐藥性，隨著化療次數的增加，化療效果會逐漸下降，限制了化療的長期療效。放療同樣是治療非小細胞肺癌的重要手段之一，它利用高能射線（如X射線、γ射線等）殺死腫瘤細胞。放療可分為根治性放療、姑息性放療和輔助放療。根治性放療適用于不能手術的早期患者或局部晚期患者，通過高劑量的射線照射，試圖達到根治腫瘤的目的；姑息性放療則主要用于緩解晚期患者的癥狀，如骨轉移引起的疼痛、腦轉移導致的顱內壓增高等；輔助放療通常在手術前后進行，術前放療可以縮小腫瘤體積，提高手術切除率，術后放療可以降低局部復發風險。對于早期不能手術的非小細胞肺癌患者，采用立體定向放療，局部控制率可達80%-90%，五年生存率約為30%-40%。放療也存在一定的不良反應，如放射性肺炎、放射性食管炎等，會給患者帶來不適，影響治療效果和生活質量。放療的適用范圍也受到腫瘤位置、大小以及患者身體狀況等因素的限制，對于一些腫瘤周圍有重要器官的患者，放療劑量和范圍的選擇需要謹慎，以免對正常組織造成過大損傷。2.3.2靶向治療與免疫治療靶向治療是近年來非小細胞肺癌治療領域的重大突破，它針對腫瘤細胞中特定的分子靶點進行精準治療。非小細胞肺癌常見的靶向突變基因有EGFR、ALK、ROS1等。以EGFR突變為例，在東亞人群中，EGFR突變率約為40%-50%。EGFR-TKI（酪氨酸激酶抑制劑）是針對EGFR突變的靶向藥物，第一代EGFR-TKI如吉非替尼、厄洛替尼，通過與EGFR激酶結構域結合，抑制其磷酸化，從而阻斷下游信號傳導，抑制腫瘤細胞增殖。臨床研究表明，對于EGFR突變陽性的非小細胞肺癌患者，使用第一代EGFR-TKI治療的客觀緩解率可達70%左右，無進展生存期約為10-12個月。然而，大多數患者在使用第一代EGFR-TKI治療9-12個月后會出現耐藥。為解決耐藥問題，第二代不可逆性EGFR-TKI如阿法替尼、達克替尼問世，它們與EGFR共價結合，親和力更強，對部分第一代藥物耐藥的患者仍有一定療效。針對T790M耐藥突變，第三代EGFR-TKI奧希替尼應運而生，它不僅對敏感突變有效，還能克服T790M耐藥突變，顯著延長患者的無進展生存期，中位無進展生存期可達18.9個月。ALK融合基因也是非小細胞肺癌的重要驅動基因之一，在非小細胞肺癌中的突變率約為3%-7%。ALK抑制劑如克唑替尼、阿來替尼、塞瑞替尼等，通過抑制ALK激酶活性，阻斷下游信號通路，從而抑制腫瘤細胞生長。克唑替尼是第一代ALK抑制劑，對ALK陽性的非小細胞肺癌患者具有較好的療效，客觀緩解率可達70%-80%，但容易出現耐藥，且對腦轉移的控制效果不佳。第二代ALK抑制劑阿來替尼和塞瑞替尼在療效和安全性上有了進一步提升，阿來替尼的中位無進展生存期長達34.8個月，且對腦轉移患者也有較好的療效，能夠顯著降低腦轉移的發生風險。第三代ALK抑制劑勞拉替尼對一、二代ALK抑制劑耐藥的患者仍有較高的活性，并且具有更強的血腦屏障穿透能力，對腦轉移患者的治療效果顯著。免疫治療是另一種新型的非小細胞肺癌治療方法，它通過激活患者自身的免疫系統來識別和攻擊腫瘤細胞。目前臨床上應用較為廣泛的是免疫檢查點抑制劑，如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑帕博利珠單抗、納武利尤單抗，以及程序性死亡受體配體1（PD-L1）抑制劑阿替利珠單抗、度伐利尤單抗等。免疫檢查點抑制劑的作用機制是阻斷腫瘤細胞表面的PD-L1與T細胞表面的PD-1結合，解除腫瘤細胞對T細胞的免疫抑制，使T細胞能夠重新識別和殺傷腫瘤細胞。對于晚期非小細胞肺癌患者，免疫治療單藥或聯合化療都取得了顯著的療效。在KEYNOTE-024研究中，對于PD-L1表達≥50%的晚期非小細胞肺癌患者，帕博利珠單抗單藥治療的中位無進展生存期為10.3個月，中位總生存期為30個月，而化療組的中位無進展生存期為6個月，中位總生存期為14.2個月。免疫治療聯合化療也顯示出更好的療效，在IMpower150研究中，阿替利珠單抗聯合化療治療晚期非小細胞肺癌患者，中位無進展生存期為8.3個月，中位總生存期為19.2個月，顯著優于單純化療組。然而，靶向治療和免疫治療也面臨一些挑戰。靶向治療的局限性在于，只有存在特定基因突變的患者才能從治療中獲益，對于沒有相應靶點的患者，靶向治療無效。而且，腫瘤細胞容易對靶向藥物產生耐藥，耐藥機制復雜，一旦出現耐藥，治療難度增大。免疫治療雖然在部分患者中取得了顯著療效，但并非所有患者都能從中受益，有效率大約在20%-40%左右。免疫治療還可能引發一系列免疫相關不良反應，如免疫性肺炎、免疫性肝炎、免疫性甲狀腺炎等，嚴重時可能危及生命。此外，免疫治療的費用較高，給患者和社會帶來了較大的經濟負擔。2.4非小細胞肺癌轉移與預后的關系轉移是影響非小細胞肺癌患者預后的關鍵因素，它極大地增加了治療難度，顯著降低了患者的生存率和生活質量。一旦非小細胞肺癌發生轉移，患者的五年生存率會急劇下降。以遠處轉移為例，當腫瘤細胞擴散到身體其他部位，如腦、骨、肝等遠處器官時，患者的五年生存率往往不足10%。這是因為遠處轉移使得腫瘤細胞難以通過手術完全切除，且轉移部位的腫瘤細胞對化療、放療等傳統治療手段的敏感性降低，導致治療效果不佳。例如，非小細胞肺癌腦轉移患者的中位生存期僅8-10個月，1年生存期為30%-35%，2年生存期只有10%-15%。這是由于腦部血腦屏障的存在，使得許多化療藥物難以有效進入腦部，對腦轉移瘤的治療效果有限，同時腦轉移瘤會引起顱內壓升高、神經功能障礙等嚴重并發癥，進一步危及患者生命。不同的轉移部位對患者生存期和生活質量有著不同程度的影響。骨轉移在非小細胞肺癌中較為常見，約30%-40%的晚期患者會發生骨轉移。骨轉移會導致患者出現骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫等癥狀，嚴重影響患者的生活質量。雖然骨轉移本身并不直接威脅生命，但會引發一系列并發癥，如骨折后的長期臥床可能導致肺部感染、深靜脈血栓等，從而間接縮短患者的生存期。發生骨轉移的患者中位生存期一般為6-12個月，5年生存率低于10%。肝轉移也是非小細胞肺癌常見的遠處轉移部位之一，一旦發生肝轉移，患者的肝功能會受到嚴重損害，出現黃疸、腹水、肝功能衰竭等癥狀。肝轉移患者的預后較差，中位生存期通常在3-6個月左右，這是因為肝臟是人體重要的代謝和解毒器官，腫瘤轉移到肝臟后，會迅速破壞肝臟的正常功能，導致機體代謝紊亂，且肝臟的血供豐富，腫瘤細胞容易在肝臟內快速生長和擴散。轉移程度同樣對患者的預后有著顯著影響。根據國際抗癌聯盟（UICC）的TNM分期系統，T代表原發腫瘤的大小和侵犯范圍，N代表區域淋巴結轉移情況，M代表遠處轉移。隨著T、N、M分期的升高，患者的轉移程度逐漸加重，預后也越來越差。例如，Ⅰ期非小細胞肺癌患者，腫瘤局限于肺部，無淋巴結轉移和遠處轉移，五年生存率可達70%左右；而Ⅳ期患者，腫瘤已發生遠處轉移，五年生存率不到10%。在淋巴結轉移方面，N0表示無淋巴結轉移，N1表示同側支氣管旁或肺門淋巴結轉移，N2表示同側縱隔和隆突下淋巴結轉移，N3表示對側縱隔、對側肺門、同側或對側斜角肌或鎖骨上淋巴結轉移。隨著淋巴結轉移程度從N0到N3逐漸加重，患者的五年生存率顯著降低，N0患者五年生存率相對較高，而N3患者五年生存率極低。這是因為淋巴結轉移程度的增加，意味著腫瘤細胞已經通過淋巴系統擴散到更多區域，手術難以徹底清除，且腫瘤細胞更容易通過淋巴系統進一步擴散到遠處器官，導致全身轉移，增加治療難度，降低患者的生存機會。三、Racl和NF-κBp65的生物學特性3.1Racl的結構與功能3.1.1Racl的結構特點Racl全稱Ras相關C3肉毒素底物1（Ras-relatedC3botulinumtoxinsubstrate1），是RhoGTP酶家族的重要成員，在細胞信號傳導、細胞骨架重組等過程中發揮關鍵作用。從分子結構來看，Racl基因定位于人類第7號染色體上，全長約29kb，包含7個外顯子。其編碼的蛋白質由約192個氨基酸組成，相對分子質量約為21kDa。Racl具有典型的RhoGTP酶結構特征，包含一個高度保守的G結構域，該結構域是其與GTP或GDP結合的關鍵區域。G結構域由5個α螺旋、6個β折疊以及若干環區組成，形成了一個緊密的三維結構。在G結構域中，存在一些關鍵的氨基酸殘基，如位于P環（phosphate-bindingloop）上的G1box（GXXXXGK[S/T]），它對于Racl與GTP的磷酸基團結合至關重要；SwitchI和SwitchII區域則在Racl結合GTP或GDP時發生顯著的構象變化，從而介導Racl與下游效應分子的相互作用。例如，當Racl結合GTP時，SwitchI和SwitchII區域會發生構象改變，暴露出與下游效應分子結合的位點，使得Racl能夠激活下游信號通路。除了G結構域，Racl還含有一個C末端的多堿性區域，該區域對于Racl在細胞膜上的定位和功能發揮具有重要作用。多堿性區域富含帶正電荷的氨基酸殘基，能夠與細胞膜上帶負電荷的磷脂分子相互作用，從而使Racl定位于細胞膜內側，便于接收來自細胞膜表面受體的信號并傳遞到細胞內。研究發現，缺失C末端多堿性區域的Racl突變體無法正常定位于細胞膜，其功能也受到顯著影響。Racl獨特的分子結構使其能夠在細胞內精準地發揮信號傳導和調控作用，為其參與多種生物學過程奠定了基礎。3.1.2Racl在細胞中的正常功能在正常細胞中，Racl參與眾多重要的生物學過程，對維持細胞的正常生理功能起著不可或缺的作用。細胞極性的建立是細胞正常生理功能的重要基礎，Racl在其中扮演著關鍵角色。以上皮細胞為例，上皮細胞具有明顯的極性，分為頂端和基底側，不同部位執行不同的功能。Racl通過調節細胞骨架的重組，促使細胞內的蛋白質和細胞器在不同區域的特異性分布，從而建立和維持上皮細胞的極性。研究表明，在極化的上皮細胞中，Racl主要分布于細胞的頂端區域，它能夠激活下游的效應分子，如PAK（p21-activatedkinase）等，PAK進一步磷酸化細胞骨架相關蛋白，調節肌動蛋白絲的組裝和排列，使得細胞頂端的微絨毛等結構得以正常形成和維持，保證上皮細胞能夠有效地進行物質運輸和信號傳遞。細胞運動是細胞實現多種生理功能的重要方式，Racl在這一過程中發揮著核心調控作用。在細胞遷移過程中，Racl通過與多種信號分子和細胞骨架成分相互作用，調節細胞的形態變化和運動方向。當細胞受到趨化因子等外界信號刺激時，細胞膜上的受體被激活，進而激活Racl。活化的Racl促進細胞前端的肌動蛋白聚合，形成片狀偽足和絲狀偽足，這些偽足向前伸展并與周圍環境相互作用，為細胞的遷移提供動力。同時，Racl還能夠調節細胞后端的黏附解除，使得細胞能夠順利地向前移動。在免疫細胞如巨噬細胞的吞噬作用中，Racl同樣發揮著重要作用。巨噬細胞通過識別和吞噬病原體來清除入侵的微生物，Racl參與調控吞噬體的形成和成熟過程。當巨噬細胞識別到病原體后，Racl被激活，它促使細胞膜局部內陷，形成吞噬泡，將病原體包裹其中。隨后，Racl繼續參與調節吞噬泡與溶酶體的融合，使吞噬體內的病原體被降解和清除。Racl在細胞周期調控中也具有重要作用。細胞周期的正常進行是細胞增殖和分化的基礎，Racl通過調節細胞周期相關蛋白的表達和活性，影響細胞周期的進程。研究發現，在細胞周期的G1期，Racl的活性對于細胞能否順利進入S期至關重要。Racl可以通過激活下游的PI3K（phosphoinositide3-kinase）-Akt信號通路，調節細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等關鍵蛋白的表達，促進細胞從G1期向S期轉換。如果Racl的功能受到抑制，細胞周期可能會停滯在G1期，影響細胞的增殖。Racl在正常細胞中的這些功能相互協調，共同維持著細胞的正常生理狀態和生命活動。3.2NF-κBp65的結構與功能3.2.1NF-κBp65的結構特點NF-κBp65，也被稱為RelA，是轉錄因子NF-κB家族中的關鍵成員。在哺乳動物中，NF-κB家族共有5個成員，分別是RelA（p65）、c-Rel、RelB、NF-κB1（p105/p50）和NF-κB2（p100/p52），它們在細胞的生理和病理過程中發揮著不可或缺的作用。NF-κBp65的分子結構具有獨特的特征，其N端擁有高度保守的Rel同源區（Relhomologyregion，RHR），該區域由N端結構域（N-terminaldomain，NTD）和C端結構域（C-terminaldomain，CTD）相互連接構成。在CTD上存在一個核定位區域（nuclear-localizationsequence，NLS），這個區域對于NF-κBp65與DNA的特異性結合、自身的二聚化以及向細胞核內的轉移過程起著關鍵作用。研究發現，當NF-κBp65需要進入細胞核發揮轉錄調控功能時，NLS會與細胞核內的輸入蛋白相互作用，從而引導NF-κBp65順利進入細胞核。RelA（p65）、c-Rel和RelB的C端還存在反式激活結構域（transactivationdomain，TD），這一結構域能夠有效地激活目標基因的轉錄過程。以NF-κBp65與p50形成的異二聚體為例，在受到細胞外刺激后，NF-κBp65的TD會招募轉錄輔助激活因子，如CBP/p300等，這些輔助激活因子能夠與RNA聚合酶Ⅱ等轉錄相關蛋白相互作用，從而啟動基因的轉錄。p50和p52與NF-κBp65有所不同，它們僅含有RHR，缺乏TD，因此，p50和p52的同源二聚體并不具備激活基因轉錄的能力，而是常常作為一種抑制分子存在于細胞內。在細胞中，p50和p52通常各自以前體p105和p100的形式存在，在特定的信號刺激下，p105和p100會被蛋白酶體裂解，從而產生具有活性的p50和p52。在受到TNF-α刺激時，細胞內的信號通路會被激活，導致IκB激酶（IKK）復合體活化，IKK進而磷酸化IκB蛋白，使IκB降解，釋放出NF-κB二聚體。此時，p105也會在蛋白酶體的作用下被裂解，產生p50，p50可以與RelA（p65）等形成異二聚體，發揮轉錄調控作用。在未接受刺激時，NF-κBp65通常與IκB抑制因子結合，以非活性狀態存在于細胞質中。IκB通過其C末端特定的錨蛋白重復序列（ankyrinrepeat–containingdomain，ARD）與NF-κB緊密結合，并覆蓋NF-κB的NLS，從而阻止NF-κB向細胞核內轉移。當細胞受到如細胞因子、脂多糖等刺激時，IκB激酶被激活，使IκB蛋白磷酸化，隨后IκB被泛素化修飾并被蛋白酶體降解，NF-κBp65得以釋放，并暴露其NLS，迅速從細胞質進入細胞核內，與核內DNA上的特異序列相結合，啟動或增強相關基因的轉錄。在TNF-α刺激細胞時，TNF-α與細胞表面的受體結合，激活下游的信號通路，使IKK復合體磷酸化IκBα，IκBα被泛素化修飾后被蛋白酶體降解，釋放出NF-κBp65/p50異二聚體，該異二聚體進入細胞核，與靶基因啟動子區域的κB位點結合，促進相關基因的轉錄。3.2.2NF-κBp65在細胞中的正常功能在正常細胞中，NF-κBp65對基因轉錄起著至關重要的調控作用，參與眾多生物學過程，是維持細胞正常生理功能的關鍵因子。在炎癥反應中，當機體受到病原體入侵或組織損傷等刺激時，免疫細胞如巨噬細胞、單核細胞等會被激活，釋放出多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。這些炎癥因子與細胞表面的受體結合，激活NF-κB信號通路，使NF-κBp65進入細胞核，啟動一系列與炎癥相關基因的轉錄。NF-κBp65可以促進IL-6、IL-8等細胞因子基因的表達，這些細胞因子能夠招募更多的免疫細胞到炎癥部位，增強免疫反應，從而幫助機體清除病原體和修復受損組織。研究表明，在小鼠炎癥模型中，抑制NF-κBp65的活性，會導致炎癥反應明顯減弱，炎癥部位的免疫細胞浸潤減少，病原體清除能力下降。NF-κBp65在免疫應答過程中也扮演著核心角色。在固有免疫中，NF-κBp65能夠促進巨噬細胞分化為M1表型，增強巨噬細胞的吞噬和殺菌能力。它還能促進樹突狀細胞的成熟和中性粒細胞的募集，提高機體的固有免疫防御能力。在適應性免疫方面，NF-κBp65可以增強B細胞的激活、增殖、成熟和選擇，促進抗體的產生。在T細胞中，NF-κBp65參與T細胞的活化和分化，調節T細胞分泌細胞因子，如在Th1細胞分化過程中，NF-κBp65通過調控相關基因的表達，促進Th1細胞分泌IFN-γ等細胞因子，增強細胞免疫應答。在病毒感染時，機體的免疫細胞會識別病毒抗原，激活NF-κB信號通路，NF-κBp65進入細胞核，調控相關基因表達，促進免疫細胞的活化和增殖，產生免疫效應分子，如抗體、細胞因子等，以清除病毒感染。細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，對于維持機體的正常生理平衡至關重要。NF-κBp65在細胞凋亡的調控中具有雙重作用。在某些情況下，NF-κBp65可以激活抗凋亡基因的表達，如Bcl-2、IAPs等，抑制細胞凋亡的發生，從而保護細胞免受損傷。在受到低劑量的紫外線照射時，細胞內的NF-κBp65被激活，它會結合到Bcl-2基因的啟動子區域，促進Bcl-2的表達，Bcl-2可以抑制線粒體釋放細胞色素c，從而阻止凋亡小體的形成，抑制細胞凋亡。然而，在另一些情況下，NF-κBp65也可以促進促凋亡基因的表達，誘導細胞凋亡。在腫瘤細胞中，過度激活的NF-κBp65有時會誘導細胞凋亡相關基因的表達，以清除異常增殖的細胞。這表明NF-κBp65在細胞凋亡中的作用取決于細胞的類型、刺激的性質和強度等多種因素。3.3Racl和NF-κBp65在腫瘤發生發展中的作用機制3.3.1Racl促進腫瘤轉移的機制Racl在非小細胞肺癌的轉移過程中發揮著核心作用，其主要通過調節細胞骨架重組和細胞間黏附等機制，有力地促進了非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲。在細胞骨架重組方面，Racl能夠激活下游的WASP-Arp2/3復合物。當Racl處于活化狀態，即與GTP結合時，它會與WASP（Wiskott-Aldrichsyndromeprotein）相互作用，改變WASP的構象，使其能夠與Arp2/3復合物結合。Arp2/3復合物是肌動蛋白聚合的關鍵啟動子，在WASP-Arp2/3復合物的作用下，肌動蛋白單體迅速聚合，形成分支狀的肌動蛋白絲網絡。這些肌動蛋白絲在細胞遷移的前端，也就是偽足部位大量聚集，推動細胞膜向前突出，形成片狀偽足和絲狀偽足。片狀偽足是一種扁平的、富含肌動蛋白的結構，它能夠在細胞遷移時與周圍環境接觸，感知并探索遷移路徑；絲狀偽足則是細長的、指狀的突起，能夠更深入地探測周圍環境，為細胞遷移提供方向指引。在非小細胞肺癌細胞的遷移過程中，Racl的激活使得細胞前端不斷形成片狀偽足和絲狀偽足，這些偽足與細胞外基質相互作用，產生牽引力，從而推動細胞向前遷移。研究表明，使用Racl抑制劑處理非小細胞肺癌細胞后，細胞內WASP-Arp2/3復合物的活性受到抑制，肌動蛋白絲的聚合減少，片狀偽足和絲狀偽足的形成受阻，細胞的遷移能力顯著下降。Racl還可以通過調節肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化來影響細胞骨架的收縮性。Racl激活下游的PAK（p21-activatedkinase），PAK能夠磷酸化MLC激酶（MLCK），使其活化。活化的MLCK進一步磷酸化MLC，增加肌動蛋白與肌球蛋白之間的相互作用，從而增強細胞骨架的收縮力。在細胞遷移過程中，細胞后端的收縮力對于細胞脫離原來的位置并向前移動至關重要。Racl通過調節MLC的磷酸化，增強細胞后端的收縮力，使得細胞能夠順利地向前遷移。在體外實驗中，抑制Racl-PAK-MLCK通路，會導致細胞后端的收縮力減弱，細胞遷移速度明顯減慢。在細胞間黏附方面，Racl對E-cadherin等細胞黏附分子的表達和功能有著重要影響。E-cadherin是一種重要的細胞間黏附分子，它能夠介導上皮細胞之間的黏附，維持上皮組織的完整性和極性。在非小細胞肺癌的轉移過程中，腫瘤細胞需要降低細胞間的黏附力，以便脫離原發灶并遷移到其他部位。研究發現，Racl可以通過激活NF-κB信號通路，抑制E-cadherin的表達。Racl活化后，激活下游的信號分子，最終導致NF-κB的活化，NF-κB進入細胞核后，與E-cadherin基因的啟動子區域結合，抑制其轉錄，從而降低E-cadherin在細胞膜上的表達。E-cadherin表達的降低使得腫瘤細胞之間的黏附力減弱，腫瘤細胞更容易從原發灶脫離，進入血液循環或淋巴循環，進而發生轉移。此外，Racl還可以通過調節其他細胞黏附分子如β-catenin等的定位和功能，進一步影響細胞間的黏附。β-catenin與E-cadherin形成復合物，共同維持細胞間的黏附。Racl的活化可以導致β-catenin從細胞膜上解離，進入細胞核，參與基因轉錄調控，從而破壞細胞間的黏附結構，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。在對非小細胞肺癌細胞系的研究中發現，過表達Racl會導致E-cadherin表達下降，β-catenin核轉位增加，細胞間黏附力減弱，細胞的侵襲能力顯著增強。3.3.2NF-κBp65促進腫瘤轉移和抵抗治療的機制NF-κBp65在非小細胞肺癌的轉移和抵抗治療過程中發揮著關鍵作用，它主要通過激活與腫瘤發生相關的基因，促進腫瘤細胞的存活、增殖和轉移，同時對化療藥物抵抗的作用機制也較為復雜。在基因激活方面，NF-κBp65作為轉錄因子，在受到細胞外刺激后，如細胞因子、生長因子等，會從細胞質轉移到細胞核內。在細胞核中，NF-κBp65與特定基因啟動子區域的κB位點緊密結合，啟動這些基因的轉錄過程。其中，與腫瘤轉移密切相關的基因如MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）、VEGF（血管內皮生長因子）等，都受到NF-κBp65的調控。MMP-9能夠降解細胞外基質中的膠原蛋白、明膠等成分，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。當NF-κBp65激活MMP-9基因的轉錄后，細胞內MMP-9的表達水平升高，MMP-9被分泌到細胞外，降解細胞外基質，使得腫瘤細胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織，并進入血液循環或淋巴循環，從而促進腫瘤的轉移。在非小細胞肺癌組織中，NF-κBp65的高表達往往伴隨著MMP-9的高表達，且兩者的表達水平與腫瘤的侵襲和轉移程度呈正相關。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和存活，促進新血管的生成。腫瘤的生長和轉移依賴于充足的血液供應，NF-κBp65激活VEGF基因的表達后，腫瘤組織中VEGF的含量增加，VEGF與血管內皮細胞表面的受體結合，激活下游信號通路，促進血管內皮細胞的增殖和遷移，形成新的血管網絡。這些新生血管為腫瘤細胞提供了營養物質和氧氣，同時也為腫瘤細胞進入血液循環提供了通道，進一步促進了腫瘤的生長和轉移。研究表明，抑制NF-κBp65的活性，可以降低VEGF的表達，減少腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉移。NF-κBp65還能夠促進腫瘤細胞的存活和增殖。它可以激活一系列抗凋亡基因的表達，如Bcl-2、IAPs（凋亡抑制蛋白）等。Bcl-2能夠抑制線粒體釋放細胞色素c，從而阻止凋亡小體的形成，抑制細胞凋亡的發生。IAPs則可以直接抑制caspase家族蛋白酶的活性，阻斷細胞凋亡信號通路。在非小細胞肺癌細胞中，NF-κBp65的持續激活使得Bcl-2和IAPs等抗凋亡基因高表達，腫瘤細胞對各種凋亡刺激的敏感性降低，從而得以存活和增殖。NF-κBp65還可以通過調節細胞周期相關基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖。它能夠上調CyclinD1等細胞周期蛋白的表達，促進細胞從G1期向S期轉換，加速細胞周期進程，使腫瘤細胞能夠快速增殖。在對非小細胞肺癌細胞系的研究中發現，抑制NF-κBp65的活性，會導致Bcl-2和CyclinD1等基因的表達下降，細胞凋亡增加，增殖受到抑制。在化療藥物抵抗方面，NF-κBp65通過多種機制賦予腫瘤細胞對化療藥物的抗性。NF-κBp65可以激活藥物外排泵相關基因的表達，如P-gp（P-糖蛋白）等。P-gp是一種跨膜蛋白，它能夠將進入細胞內的化療藥物泵出細胞外，降低細胞內藥物濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物產生抗性。當NF-κBp65激活P-gp基因的轉錄后，腫瘤細胞表面P-gp的表達增加，化療藥物被不斷泵出細胞，導致化療效果降低。研究表明，在對化療藥物耐藥的非小細胞肺癌細胞中，NF-κBp65的活性較高，P-gp的表達也顯著升高，通過抑制NF-κBp65的活性，可以降低P-gp的表達，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。NF-κBp65還可以通過調節細胞內的氧化還原狀態和DNA損傷修復機制，增強腫瘤細胞對化療藥物的抵抗能力。化療藥物往往會引起腫瘤細胞內活性氧（ROS）的產生和DNA損傷，從而誘導細胞凋亡。NF-κBp65可以激活抗氧化基因的表達，如SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（過氧化氫酶）等，這些抗氧化酶能夠清除細胞內的ROS，減輕氧化應激損傷，使腫瘤細胞能夠在化療藥物的作用下存活。NF-κBp65還可以促進DNA損傷修復相關基因的表達，如ATM（共濟失調毛細血管擴張突變蛋白）、ATR（ATM和Rad3相關蛋白）等，增強腫瘤細胞對化療藥物引起的DNA損傷的修復能力，從而降低化療藥物的殺傷作用。在體外實驗中，抑制NF-κBp65的活性，會導致腫瘤細胞內ROS水平升高，DNA損傷修復能力下降，對化療藥物的敏感性顯著提高。四、研究設計與方法4.1病例采集本研究選取[具體醫院名稱]在[具體時間段，如2018年1月至2022年12月]期間收治的非小細胞肺癌患者的組織標本作為研究對象。共收集到[X]例非小細胞肺癌組織標本，所有患者均經病理組織學和/或細胞學檢查確診為非小細胞肺癌，診斷依據嚴格遵循世界衛生組織（WHO）制定的肺癌分類標準。在病例選擇過程中，嚴格設定了入選標準和排除標準。入選標準如下：患者年齡在18-75歲之間；患者均接受了手術治療，且手術切除標本質量符合后續實驗檢測要求；患者簽署了知情同意書，自愿參與本研究。排除標準為：合并其他惡性腫瘤病史的患者；患有嚴重心、肝、腎等重要臟器功能障礙，無法耐受手術或影響實驗結果判斷的患者；術前接受過放療、化療、靶向治療或免疫治療的患者，以免這些治療手段對Racl和NF-κBp65的表達產生干擾。根據患者的腫瘤是否發生轉移，將非小細胞肺癌組織標本分為轉移組和非轉移組。轉移組患者經影像學檢查（如胸部增強CT、頭部增強MRI、全身骨掃描、18F-FDGPET/CT等）及術后病理檢查證實存在遠處轉移或區域淋巴結轉移。例如，對于懷疑腦轉移的患者，通過頭部增強MRI檢查發現腦部有異常占位，且經病理活檢證實為肺癌腦轉移；對于懷疑骨轉移的患者，全身骨掃描顯示有放射性濃聚灶，結合臨床癥狀和其他檢查進一步確診。非轉移組患者則在術前影像學檢查及術后病理檢查中均未發現轉移跡象。轉移組共納入[X1]例患者，非轉移組納入[X2]例患者。同時，為了對比分析，還采集了[X3]例正常肺組織標本。這些正常肺組織標本來源于因肺部良性疾病（如肺錯構瘤、肺囊腫等）接受手術切除的患者，且距離腫瘤邊緣至少5cm以上，經病理檢查證實為正常肺組織。正常肺組織標本的采集有助于明確Racl和NF-κBp65在正常組織和腫瘤組織中的表達差異，為研究它們在非小細胞肺癌發生發展中的作用提供更有力的對照依據。所有組織標本在手術切除后，立即放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，以備后續實驗檢測使用。4.2實驗方法4.2.1免疫組織化學染色免疫組織化學染色是一種利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原的定位、定性及定量的研究方法。本研究采用免疫組織化學染色方法檢測Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌組織和正常肺組織中的表達情況。在實驗前，需確保所有實驗所需的試劑、器材和設備都已準備齊全。主要試劑包括特異性一抗（兔抗人Racl多克隆抗體和兔抗人NF-κBp65多克隆抗體）、二抗（山羊抗兔IgG抗體，標記有辣根過氧化物酶）、抗原修復液（檸檬酸緩沖液或EDTA緩沖液）、封閉液（5%牛血清白蛋白的PBS溶液）、DAB顯色液等。器材涵蓋顯微鏡、離心機、微量移液器、培養箱等，設備需進行適當的清潔和消毒，以維持實驗環境的無菌狀態。組織樣本的準備是關鍵步驟。選擇合適的組織樣本后，使用10%中性緩沖福爾馬林固定液進行固定，固定時間一般為24小時，隨后將組織轉移至PBS緩沖液中保存。固定后的組織樣本需歷經脫水、透明化和浸蠟等步驟，然后進行切片，切片厚度通常設定為4-6微米，將切片放置于玻片上，以便進行后續處理。切片的脫蠟和再水化是必不可少的環節。將切片置于60℃烤箱中烘烤1小時，以增強切片與玻片的黏附性。接著依次用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡10分鐘進行脫蠟，隨后通過梯度酒精（100%、95%、80%、70%，各2分鐘）進行再水化，最后用蒸餾水洗5分鐘，共2次，以徹底去除切片上的石蠟和酒精。抗原修復是提高抗體特異性的重要步驟。選擇適當的抗原修復液（如檸檬酸緩沖液或EDTA緩沖液），將其加熱至沸騰并保持10-20分鐘，以去除固定過程中可能產生的抗原遮蔽效應。之后將切片轉移至冷卻緩沖液中，待其冷卻至室溫。封閉非特異性結合位點可有效減少背景染色。用封閉液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）處理切片，在室溫下孵育30分鐘。加入一抗是檢測目標蛋白的關鍵步驟。將一抗稀釋至適當濃度（根據抗體說明書進行稀釋，通常Racl抗體稀釋比例為1:100-1:200，NF-κBp65抗體稀釋比例為1:150-1:300），滴加在切片上。覆蓋切片后，置于濕箱中在4°C下孵育過夜，以保證抗體與抗原充分結合。洗滌切片以去除未結合的一抗。用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。加入二抗時，將二抗稀釋至適當濃度（常用稀釋比例為1:200-1:500），滴加在切片上。二抗應選擇針對一抗的相應標記抗體，本研究使用的是標記有辣根過氧化物酶的山羊抗兔IgG抗體。孵育時間為30分鐘，孵育條件為室溫，同時要避免光照。再次洗滌切片以去除未結合的二抗，洗滌操作與加入一抗后的洗滌步驟相同。顯色反應是使目標蛋白可視化的重要過程。使用HRP標記的二抗時，需加入DAB顯色液，并在顯微鏡下密切觀察反應情況。顯色時間應根據試劑說明書進行調節，一般為3-10分鐘，要避免過度顯色。當觀察到切片上出現清晰的棕色反應產物時，立即用自來水沖洗以結束顯色反應。封片是為了保護切片和便于觀察。將封片劑均勻涂布在切片上，蓋上蓋玻片。封片劑應選擇適合長期保存切片的試劑，如DPX膠。封片后，將切片置于室溫下干燥。最后，使用光學顯微鏡觀察染色結果。根據顯色反應的強弱、位置及形態特征分析組織中的抗原分布情況。記錄觀察結果，并進行圖像拍攝和數據分析。在分析結果時，要觀察抗原與抗體的結合是否具有特異性，通過對比實驗組和對照組的染色情況，檢查實驗組是否顯示了預期的抗原定位和表達。同時，分析組織切片上的染色強度是否符合預期，染色過強可能表明背景信號較高，染色不足可能表明抗體濃度不足或其他實驗條件不佳，需調整抗體濃度和顯色時間，優化染色條件以獲得最佳結果。還要仔細觀察染色信號的定位是否與預期的抗原位置一致，信號應與組織結構、細胞類型和抗原的已知分布模式相符，若信號分布不均或出現非特異性背景，則需檢查抗體處理過程中的潛在問題。此外，要檢查背景染色的程度，背景染色可能由于非特異性結合、染色液過多或封閉不完全等原因引起，適當優化封閉步驟和洗滌條件，可減少背景染色的影響。為確保結果的穩定性，應對實驗結果進行多次重復實驗。免疫組織化學染色方法具有特異性強、靈敏度高、定位準確等優勢。它能夠在組織原位檢測目標蛋白的表達，直觀地顯示蛋白在細胞和組織中的分布情況，為研究Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌中的作用提供了重要的形態學依據。通過該方法，可以清晰地觀察到Racl和NF-κBp65在肺癌組織和正常肺組織中的表達差異，以及它們在不同細胞類型和組織結構中的定位，有助于深入了解它們在非小細胞肺癌發生發展過程中的作用機制。4.2.2蛋白質印跡分析蛋白質印跡分析，也被稱為免疫印跡法，是一種能夠檢測固定在固相載體上蛋白質的免疫化學技術方法，在本研究中用于檢測Racl和NF-κBp65的表達水平。該方法利用了蛋白質的電泳分離、電轉移以及抗原抗體特異性結合的原理，對待測蛋白進行定性和半定量分析。實驗開始前，需要準備好SDS/PAGE實驗相關材料，包括不同濃度的丙烯酰胺、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris-HCl緩沖液、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）等，用于制備聚丙烯酰胺凝膠。還需要電轉移裝置、供電設備、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）、Whatman3MM紙，以及鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、淺盤等工具。實驗試劑方面，除了上述用于凝膠制備的試劑外，還需要10x轉移緩沖溶液（由30.3gTrizmabase和144g甘氨酸加蒸餾水至1L配制而成，pH約為8.3）、1x轉移緩沖溶液（在1.4L蒸餾水中加入400ml甲醇及200ml10x轉移緩沖溶液配制）、TBS緩沖溶液（將1.22gTris和8.78gNaCl加入到1L蒸餾水中，用HCl調節pH至7.5）、TTBSbuffer（在1LTBS緩沖溶液中加入0.5mlTween20）、一抗（兔抗人Racl多克隆抗體和兔抗人NF-κBp65多克隆抗體）、二抗（辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體）、3%封阻緩沖溶液（牛血清白蛋白15mg加入TBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾后在4°C保存）、0.5%封阻緩沖溶液（牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾后在4°C保存）、顯影試劑（由1ml氯萘溶液、10ml甲醇、TBS緩沖溶液及30ul30%H2O2配制而成）。首先進行蛋白質的提取。取適量的非小細胞肺癌組織和正常肺組織樣本，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液，在冰上充分勻漿，然后在4°C下以12000rpm的轉速離心30分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白濃度調整一致，以便后續實驗。根據目的蛋白的性質，利用電泳方法將其進行分離。為提高電轉移的效率，通常采用SDS/PAGE技術。按照配方配制分離膠和濃縮膠，將處理好的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，加熱變性后上樣到凝膠孔中。同時，加入蛋白質分子量標準品，用于判斷目的蛋白的分子量大小。在電泳過程中，先在低電壓下進行濃縮膠電泳，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶，然后升高電壓進行分離膠電泳，使不同分子量的蛋白質在分離膠中按照分子量大小進行分離。分離實驗結束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀去除，然后在膠板的右上角切一個小口以便定位，小心放入轉移緩沖溶液中待用。準備PVDF膜。根據膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘，使其活化，再移至轉移緩沖溶液中待用。制作膠膜夾心。在一淺盤中打開轉移盒，將一個預先用轉移緩沖溶液浸泡過的海綿墊放在轉移盒的黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經轉移緩沖溶液浸濕的3MM紙，小心地將膠板放在3MM紙上，并注意排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉移緩沖溶液浸濕過的3MM紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過的海綿墊，關閉轉移盒。將轉移盒按照正確的方向放入轉移槽中，轉移盒的黑色篩孔板貼近轉移槽的黑色端，轉移盒的白色篩孔板貼近轉移槽的白色端，填滿轉移緩沖溶液同時防止出現氣泡。電轉移。連接電源，在4°C條件下維持恒壓100v，轉移1小時。通過電流的作用，凝膠中的蛋白質被轉移到PVDF膜上。免疫檢測。斷開電源，將轉移盒從轉移槽中移出，將轉移盒的各個部分分開。用鑷子將PVDF膜小心放入一個干凈的容器中，用TBS緩沖溶液進行短暫清洗。從膜上剪下一條寬約5mm的膜放入另一個干凈的容器中，將這條膜在染色液中浸泡1分鐘，然后在脫色液中脫色30分鐘，確定蛋白質已經轉移到PVDF膜上。對于沒有進行染色的膜，首先倒出TBS緩沖溶液，加入3%封閉緩沖溶液，輕輕搖動至少1小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。倒掉3%封閉緩沖溶液，并用TBS緩沖溶液清洗3次，每次5分鐘。倒掉TBS緩沖溶液，加入10ml0.5%封閉緩沖溶液及適量的一抗（根據抗體說明書確定一抗的稀釋比例和用量，通常Racl抗體稀釋比例為1:500-1:1000，NF-κBp65抗體稀釋比例為1:800-1:1500），輕輕搖動1小時以上，使一抗與目的蛋白充分結合。用TTBSbuffer洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結合的一抗。加入適量的二抗（辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體，稀釋比例一般為1:1000-1:2000），在室溫下孵育1小時。再次用TTBSbuffer洗滌膜3次，每次10分鐘，去除未結合的二抗。顯色。將顯影試劑按照配方配制好，加入到含有PVDF膜的容器中，在暗室中反應數分鐘，當觀察到膜上出現清晰的條帶時，用蒸餾水沖洗膜以終止反應。使用凝膠成像系統對膜進行掃描，獲取圖像。分析條帶。通過分析條帶的灰度值，與內參蛋白（常用的內參蛋白有β-actin、GAPDH等）的灰度值進行比較，計算出Racl和NF-κBp65蛋白的相對表達量，從而實現對蛋白表達水平的半定量分析。蛋白質印跡分析方法能夠準確地檢測蛋白質的表達水平，通過與內參蛋白的比較，可以排除實驗過程中的誤差，實現對Racl和NF-κBp65表達的半定量分析，為研究它們在非小細胞肺癌中的表達變化提供了可靠的數據支持。該方法具有較高的靈敏度和特異性，能夠檢測到低豐度的蛋白質表達變化，有助于深入研究Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌發生發展過程中的作用機制。4.3數據分析方法本研究采用SPSS22.0統計學軟件對實驗數據進行分析處理，以確保研究結果的準確性和可靠性。對于Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌組織和正常肺組織中的表達水平數據，若數據呈正態分布，采用獨立樣本t檢驗進行兩組間的比較，分析肺癌組織與正常肺組織中兩者表達水平的差異是否具有統計學意義。當涉及多組比較時，如不同TNM分期的肺癌組織中Racl和NF-κBp65表達水平的比較，采用方差分析（One-WayANOVA），若方差分析結果顯示存在組間差異，則進一步進行LSD（最小顯著差異法）或Dunnett'sT3等多重比較方法，以明確具體哪些組之間存在顯著差異。在分析Racl和NF-κBp65的表達水平與非小細胞肺癌患者的臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移等）之間的相關性時，若數據為連續性變量且呈正態分布，采用Pearson相關分析；若數據不滿足正態分布或為等級資料，如分化程度分為高、中、低分化，TNM分期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期等，則采用Spearman秩相關分析。通過相關分析，計算相關系數r或rs，判斷兩者之間是否存在線性相關或等級相關關系，并確定相關性的強弱和方向。運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，分析Racl和NF-κBp65的表達與患者生存時間的關系。將患者按照Racl和NF-κBp65的表達水平分為高表達組和低表達組，分別計算兩組患者的生存率，并繪制生存曲線。通過Log-rank檢驗對兩組生存曲線進行比較，判斷兩組生存率之間是否存在顯著差異，若P<0.05，則認為兩組生存率差異有統計學意義，即Racl和NF-κBp65的表達與患者生存時間相關。使用Cox風險比例模型進行多因素分析，將單因素分析中具有統計學意義的因素（如Racl和NF-κBp65的表達、TNM分期、淋巴結轉移等）納入模型，篩選出影響非小細胞肺癌患者預后的獨立危險因素。通過計算風險比（HR）及其95%置信區間（CI），評估每個因素對患者預后的影響程度。若某因素的HR>1且95%CI不包含1，則表明該因素是危險因素，即其表達水平升高會增加患者死亡的風險；若HR<1且95%CI不包含1，則表明該因素是保護因素，其表達水平升高會降低患者死亡的風險。在所有統計分析中，均以P<0.05作為差異具有統計學意義的標準，以確保研究結果的可靠性和科學性。五、研究結果5.1Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌組織中的表達情況通過免疫組織化學染色，對非小細胞肺癌組織和正常肺組織中Racl和NF-κBp65的表達進行檢測，結果顯示，Racl在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率為[X]%（[陽性例數]/[總例數]），而在正常肺組織中的陽性表達率僅為[Y]%（[陽性例數]/[總例數]）。在肺癌組織中，Racl主要表達于癌細胞的細胞質和細胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，陽性染色強度較高，且在腫瘤細胞密集區域表達更為明顯。正常肺組織中，Racl的表達較弱，僅在少數肺泡上皮細胞和支氣管上皮細胞中可見微弱的陽性染色。NF-κBp65在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率為[Z]%（[陽性例數]/[總例數]），在正常肺組織中的陽性表達率為[W]%（[陽性例數]/[總例數]）。在肺癌組織中，NF-κBp65主要定位于細胞核，也有部分表達于細胞質，細胞核陽性染色表現為棕黃色或棕褐色，細胞質染色相對較淺。在正常肺組織中，NF-κBp65的陽性表達主要見于支氣管上皮細胞和少量肺泡巨噬細胞，表達強度明顯低于肺癌組織。進一步采用蛋白質印跡分析對Racl和NF-κBp65的表達水平進行半定量檢測。結果表明，非小細胞肺癌組織中Racl蛋白的相對表達量（以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示）為[Racl相對表達量均值]±[標準差]，顯著高于正常肺組織中的[Racl相對表達量均值]±[標準差]，差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。NF-κBp65蛋白在非小細胞肺癌組織中的相對表達量為[NF-κBp65相對表達量均值]±[標準差]，同樣顯著高于正常肺組織中的[NF-κBp65相對表達量均值]±[標準差]，差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。免疫組織化學染色和蛋白質印跡分析結果均顯示，Racl和NF-κBp65在非小細胞肺癌組織中的表達水平明顯高于正常肺組織，提示它們可能在非小細胞肺癌的發生發展過程中發揮重要作用。5.2Racl和NF-κBp65表達與非小細胞肺癌轉移的關系為了深入探究Racl和NF-κBp65表達與非小細胞肺癌轉移的關聯，本研究對轉移組和非轉移組患者腫瘤組織中Racl和NF-κBp65的表達進行了詳細分析。通過免疫組織化學染色結果顯示，轉移組中Racl的陽性表達率為[X1]%（[轉移組陽性例數]/[轉移組總例數]），顯著高于非轉移組的[X2]%（[非轉移組陽性例數]/[非轉移組總例數]）。在蛋白質印跡分析中，轉移組Racl蛋白的相對表達量為[Racl轉移組相對表達量均值]±[標準差]，同樣顯著高于非轉移組的[Racl非轉移組相對表達量均值]±[標準差]，經獨立樣本t檢驗，差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。這表明Racl在發生轉移的非小細胞肺癌組織中表達明顯升高，提示其可能在腫瘤轉移過程中發揮重要的促進作用。從細胞層面來看，Racl的高表達能夠激活下游的WASP-Arp2/3復合物，促進肌動蛋白的聚合，使得腫瘤細胞能夠形成更多的片狀偽足和絲狀偽足，增強細胞的遷移和侵襲能力。當Racl表達升高時，腫瘤細胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織，進而進入血液循環或淋巴循環，實現腫瘤的轉移。在NF-κBp65的表達分析中，免疫組織化學染色顯示，轉移組中NF-κBp65的陽性表達率為[Y1]%（[轉移組陽性例數]/[轉移組總例數]），明顯高于非轉移組的[Y2]%（[非轉移組陽性例數]/[非轉移組總例數]）。蛋白質印跡分析結果也表明，轉移組NF-κBp65蛋白的相對表達量為[NF-κBp65轉移組相對表達量均值]±[標準差]，顯著高于非轉移組的[NF-κBp65非轉移組相對表達量均值]±[標準差]，差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。NF-κBp65作為轉錄因子，其高表達會激活一系列與腫瘤轉移相關的基因。它能夠上調MMP-9的表達，MMP-9可以降解細胞外基質中的膠原蛋白、明膠等成分，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。NF-κBp65還能促進VEGF的表達，刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和存活，促進新血管的生成，為腫瘤細胞的轉移提供營養物質和氧氣，同時也為腫瘤細胞進入血液循環提供了通道。通過Spearman秩相關分析，進一步探究Racl和NF-κBp65表達與非小細胞肺癌轉移相關臨床病理特征（如TNM分期、淋巴結轉移等）的相關性。結果顯示，Racl和NF-κBp65的表達水平均與TNM分期呈顯著正相關（Racl與TNM分期的rs=[相關系數]，P<0.05；NF-κBp65與TNM分期的rs=[相關系數]，P<0.05）。隨著TNM分期的升高，Racl和NF-κBp65的表達水平逐漸增加，這表明在腫瘤進展過程中，Racl和NF-κBp65的高表達與腫瘤