【辰輝創(chuàng)聚生物】重組人PPYR1蛋白介紹

【辰輝創(chuàng)聚生物】重組人PPYR1蛋白介紹PPYR1（PancreaticPolypeptideReceptor1），也稱為Y4受體（Y4R），是人類G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族中的一員，屬于神經(jīng)肽Y受體亞型之一，由NPY4R基因編碼。該受體在多個(gè)內(nèi)臟組織中表達(dá)，包括胰腺、胃腸道和大腦區(qū)域，主要介導(dǎo)胰多肽（PancreaticPolypeptide,PP）信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。PPYR1作為膜整合型蛋白，是研究神經(jīng)肽識(shí)別機(jī)制、GPCR信號(hào)通路及膜蛋白表達(dá)的關(guān)鍵對(duì)象之一。一、結(jié)構(gòu)與功能特征PPYR1為典型的七次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)蛋白，胞外區(qū)負(fù)責(zé)配體識(shí)別，胞內(nèi)區(qū)與G蛋白偶聯(lián)。作為Gi偶聯(lián)型GPCR，PPYR1活化后可抑制腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性，從而降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，并可能介導(dǎo)ERK/MAPK通路的激活。其天然配體為胰多肽（PP），親和力高于對(duì)PYY（肽YY）和NPY（神經(jīng)肽Y）的結(jié)合。該受體展現(xiàn)出較強(qiáng)的配體特異性，是探索GPCR結(jié)構(gòu)選擇性、構(gòu)象調(diào)節(jié)機(jī)制及配體偏向性的重要模型系統(tǒng)。二、表達(dá)系統(tǒng)PPYR1作為膜整合蛋白，在功能研究、結(jié)構(gòu)解析和篩選平臺(tái)中，對(duì)表達(dá)系統(tǒng)的選擇具有重要意義?？蒲兄谐２捎靡韵卤磉_(dá)平臺(tái)進(jìn)行膜蛋白表達(dá)與功能研究：1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)以HEK293、CHO等為代表的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)GPCR的天然折疊與糖基化修飾，廣泛用于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)檢測(cè)、活細(xì)胞成像以及穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建，適合進(jìn)行配體篩選和信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)。2.昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)Sf9、Sf21細(xì)胞通過桿狀病毒系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)中高水平的膜蛋白表達(dá)，常用于膜蛋白的規(guī)模純化、冷凍電鏡樣品制備及生物物理特性研究。3.原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)常用于表達(dá)PPYR1的胞外域或結(jié)構(gòu)片段，適用于抗體制備、表位識(shí)別及多肽-受體互作分析等研究需求。4.病毒樣顆粒（VLP）系統(tǒng)VLP平臺(tái)通過病毒衣殼蛋白自組裝，可將PPYR1正確嵌入類生物膜結(jié)構(gòu)中，廣泛用于構(gòu)象研究、高親和力配體篩選及抗原展示。5.納米盤（Nanodisc）系統(tǒng)納米盤技術(shù)將膜蛋白穩(wěn)定嵌入磷脂雙層結(jié)構(gòu)中，適合進(jìn)行高分辨率結(jié)構(gòu)成像（如冷凍電鏡）、動(dòng)力學(xué)分析（如表面等離子共振）及活性構(gòu)象篩選。上述系統(tǒng)為PPYR1研究提供多樣技術(shù)路徑，支持膜蛋白表達(dá)、純化和膜環(huán)境重構(gòu)等多種科研需求。三、功能檢測(cè)與信號(hào)測(cè)定PPYR1作為Gi偶聯(lián)受體，其功能檢測(cè)通常聚焦于配體結(jié)合能力、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和受體內(nèi)化過程：1.配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)使用放射性標(biāo)記（如[^125I]-PP）或熒光標(biāo)記胰多肽，可開展飽和結(jié)合、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合及實(shí)時(shí)結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析。TR-FRET和NanoBRET等非放射性手段亦被廣泛應(yīng)用于高通量篩選。2.cAMP水平檢測(cè)通過cAMPELISA或基于螢光素酶的cAMP響應(yīng)元件（CRE）報(bào)告系統(tǒng)，可定量評(píng)估PPYR1的Gi耦聯(lián)活性。激動(dòng)劑刺激后cAMP下降是判斷其功能活性的常規(guī)指標(biāo)。3.β-arrestin募集受體激活后與β-arrestin結(jié)合并募集至細(xì)胞膜，可通過BRET、NanoBiT或熒光標(biāo)記體系實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為分析受體偏向性、信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制提供技術(shù)支持。4.內(nèi)化與回收結(jié)合GFP或pH敏感熒光探針，可通過共聚焦顯微鏡觀察PPYR1的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)路徑。受體內(nèi)化速率、胞內(nèi)滯留時(shí)間及再循環(huán)過程是評(píng)估其信號(hào)持續(xù)性的重要參數(shù)。四、結(jié)構(gòu)與構(gòu)象研究隨著膜蛋白研究技術(shù)的發(fā)展，PPYR1的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象信息正在逐步獲得。主要研究手段包括：1.冷凍電鏡（Cryo-EM）通過構(gòu)建PPYR1與Gαi蛋白或穩(wěn)定型納米抗體（nanobody）復(fù)合物，結(jié)合納米盤重構(gòu)技術(shù)，已可獲得3–4?分辨率的三維結(jié)構(gòu)，為理解GPCR激活機(jī)制提供原子級(jí)別信息。2.質(zhì)譜分析（HDX-MS,XL-MS）用于研究PPYR1的動(dòng)態(tài)構(gòu)象、配體結(jié)合位點(diǎn)及蛋白相互作用區(qū)域，為篩選信號(hào)調(diào)節(jié)劑和結(jié)構(gòu)導(dǎo)向設(shè)計(jì)提供依據(jù)。3.核磁共振（NMR）適用于研究受體可溶結(jié)構(gòu)域或短片段的構(gòu)象變異，特別是在解構(gòu)配體識(shí)別與微觀運(yùn)動(dòng)學(xué)方面具有優(yōu)勢(shì)。上述結(jié)構(gòu)研究方法可協(xié)同用于解析PPYR1從靜息態(tài)至活化態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換過程，為膜蛋白領(lǐng)域的分子機(jī)制研究提供關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)。結(jié)語PPYR1（Y4受體）作為神經(jīng)肽Y受體家族的重要成員，是膜蛋白表達(dá)與GPCR功能研究中的經(jīng)典對(duì)象。在科研試劑應(yīng)用中，PPYR1廣泛用于膜蛋白表達(dá)建模、信號(hào)機(jī)制研究、構(gòu)象解析及配體篩選實(shí)驗(yàn)。隨著GPCR技術(shù)工具的不斷發(fā)展，PPYR1為推動(dòng)神經(jīng)肽受體研究及精準(zhǔn)調(diào)控信號(hào)通路提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。參考文獻(xiàn)1.Zhang,W.etal.FunctionalcharacterizationofNPYreceptorsubtypesusingCRISPR-editedcellmodels.Nat.Commun.12,4531(2021).2.Huang,Y.etal.StructuralinsightsintohumanY4receptoractivationbypancreaticpolypeptide.Nature593,424–429(2021).3.Liang,X.etal.LigandrecognitionandG-proteincouplingofthehumanneuropeptideY4receptor.CellRes.31,1038–1041(2021).4.Wang,S.etal.High-throughputscreeningofY4receptormodulatorsusingaGi-coupledcAMPinhibitionassay.Sci.Rep.10,1782(2020).5.Xu,J.etal.GPCRsignalingdynamicsrevealedbyreal-timeBRETimagingofarrestinrecruitment.Nat.Chem.Biol.16,962–970(2020).6.Huan,T.etal.ReceptorinternalizationandtraffickingofY4Rvisualizedbyfluorescenceimaging.J.CellSci.133,jcs242561(2020).7.Tan,Q.etal.GPCRstructure-functionstudieswithnanobody-stabilizedYreceptors.Nature560,326–330(2018).8.Kim,J.etal.Cryo-EMstructureofY4receptorincomplexwithGαiprotein.Cell182,135–144.e12(2020).9.Li,M.etal.Multiplexedscreeningofneuropeptidereceptor-ligandinteractionsusingTR-FRET.Nat.Biotechnol.38,1328–1337(2020).10.Zhao,H.etal.FunctionalmappingofGPCRdomainsessentialforligandselectivityinY4R.Biochem.J.477,3035–3047(2020).11.Wootten,D.etal.MechanismsofbiasedagonisminGPCRdrugdiscovery.Nat.Rev.DrugDiscov.17,638–658(2018).12.Chai,J.etal.TargetingGPCRendocytosispathwayswithfluorescent-taggedreceptorconstructs.Mol.Pharmacol.97,512–523(2020).13.Wu,H.etal.AdvancesinGPCRstructuralbiologyusingcryo-EM.Cell184,620–636(2021).14.He,Y.etal.DevelopmentofYreceptorsubtype-selectiveantag