miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化調(diào)控機(jī)制的深度解析

miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化調(diào)控機(jī)制的深度解析一、引言1.1研究背景在生命科學(xué)領(lǐng)域，內(nèi)皮祖細(xì)胞（EndothelialProgenitorCells，EPCs）作為一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，近年來備受關(guān)注。內(nèi)皮祖細(xì)胞主要存在于骨髓，外周血及臍血中，能循環(huán)、歸巢并分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血管新生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在組織修復(fù)和再生中具有重要意義。比如在缺血性疾病治療中，內(nèi)皮祖細(xì)胞可被動(dòng)員至缺血部位，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新血管生成，改善局部血供，為組織修復(fù)提供必要的營養(yǎng)和氧氣。在骨折愈合過程中，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管生成效應(yīng)與增加的親血管生成因子如hVEGF、hFGF2和hHGF的局部水平相關(guān)，有利于血管增生及更快的骨折愈合。同時(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管組織工程、靶向藥物治療、腫瘤治療等方面也展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性、長度為18-25nt的單鏈非編碼小RNA分子，通過與靶基因3’非編碼區(qū)結(jié)合，特異性調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與細(xì)胞的增殖、分裂、分化、凋亡等多種生理過程。其中，miR-126作為一種在內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)的miRNA，與血管的生成、再生、修復(fù)密切相關(guān)。大量研究表明，miR-126在維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性、炎癥反應(yīng)、血管再生及血管修復(fù)過程中發(fā)揮著顯著作用。在血管生成過程中，miR-126可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，進(jìn)而影響新血管的生成。鑒于內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化在組織修復(fù)和再生等方面的重要性，以及miR-126在血管相關(guān)生理過程中的關(guān)鍵調(diào)控作用，深入研究miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的調(diào)控機(jī)制具有迫切的必要性。這不僅有助于我們從分子層面深入理解血管生成和組織修復(fù)的生物學(xué)過程，還可能為心血管疾病、缺血性疾病等的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的調(diào)控機(jī)制。通過一系列實(shí)驗(yàn)手段，如細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)技術(shù)、基因編輯等，明確miR-126在調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞向不同細(xì)胞類型分化過程中的作用，鑒定其潛在的靶基因和相關(guān)信號(hào)通路。本研究成果具有重要的理論意義。深入解析miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的調(diào)控機(jī)制，有助于填補(bǔ)該領(lǐng)域在分子調(diào)控層面的部分空白，進(jìn)一步完善血管生成和組織修復(fù)的理論體系。這將為理解正常生理狀態(tài)下血管發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)維持提供新的視角，也能為闡釋相關(guān)病理狀態(tài)下血管異常和組織修復(fù)障礙的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在實(shí)際應(yīng)用方面，本研究也有著重大意義。對于心血管疾病的治療而言，為開發(fā)新型治療策略提供理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。若能明確miR-126調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，就有可能通過干預(yù)這一過程，促進(jìn)血管新生和修復(fù)，改善心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的病理進(jìn)程。在組織工程血管構(gòu)建領(lǐng)域，了解miR-126的調(diào)控作用，有助于優(yōu)化內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方案，提高構(gòu)建組織工程血管的質(zhì)量和功能，為血管替代物的研發(fā)提供新思路。此外，在缺血性疾病治療、創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域，本研究成果也可能發(fā)揮積極作用，為相關(guān)疾病的治療提供新的方法和策略，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。二、內(nèi)皮祖細(xì)胞與miR-126概述2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞2.1.1內(nèi)皮祖細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與定義在1997年之前，成年個(gè)體的血管新生方式被普遍認(rèn)為只有從已存在的血管內(nèi)皮細(xì)胞以出芽、遷移等方式形成新血管，即血管新生（angiogenesis）。這種觀點(diǎn)認(rèn)為，在成年階段，血管系統(tǒng)的發(fā)育主要依賴于已有的血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行擴(kuò)展和重塑，而不是從頭開始形成新的血管。然而，1997年，日本學(xué)者Asahara等取得了突破性的發(fā)現(xiàn)。他們在人的外周循環(huán)血中成功分離得到一類特殊的細(xì)胞，這類細(xì)胞同時(shí)具備內(nèi)皮細(xì)胞及祖細(xì)胞的特性。Asahara團(tuán)隊(duì)通過一系列實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測、體外培養(yǎng)觀察其分化能力等，證實(shí)了這些細(xì)胞能夠在特定條件下增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)認(rèn)知，開啟了內(nèi)皮祖細(xì)胞研究的新篇章。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EndothelialProgenitorCells，EPCs）被定義為一種能夠自我更新并分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的多能干細(xì)胞。從干細(xì)胞分類角度來看，內(nèi)皮祖細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，它主要存在于骨髓、外周血、臍血等組織中。在胚胎發(fā)育過程中，內(nèi)皮祖細(xì)胞參與了胚胎血管生成，對構(gòu)建最初的血管網(wǎng)絡(luò)起著關(guān)鍵作用。在出生后的個(gè)體中，內(nèi)皮祖細(xì)胞依然存在，并且在血管新生過程中扮演著不可或缺的角色。當(dāng)機(jī)體受到缺血、損傷等刺激時(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠被動(dòng)員，從骨髓等儲(chǔ)存部位釋放到外周血中，然后遷移到受損或缺血部位，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，參與新血管的形成，從而實(shí)現(xiàn)血管的修復(fù)和再生。例如，在心肌梗死發(fā)生后，內(nèi)皮祖細(xì)胞會(huì)被募集到受損的心肌組織，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新血管生成，改善心肌的血液供應(yīng)，對心肌組織的修復(fù)和功能恢復(fù)具有重要意義。2.1.2內(nèi)皮祖細(xì)胞的來源與鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞的來源主要包括骨髓、臍靜脈血、成人外周血等。目前普遍認(rèn)為，內(nèi)皮祖細(xì)胞與造血干細(xì)胞起源于共同的干細(xì)胞——血液血管母細(xì)胞（hemangioblast）。外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞又起源于骨髓，而臍血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞起源于胎兒的肝臟。在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮祖細(xì)胞在這些組織中的數(shù)量極少，如外周血中約為2-3個(gè)/mL，臍血中的數(shù)量約是外周血的3.5倍。但在含有血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF）等適合其生長的培養(yǎng)條件下，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以大量增殖擴(kuò)增。對于內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定，目前尚無單一的特異性表面標(biāo)志，主要通過多種表面標(biāo)志物的組合來識(shí)別。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CD34+細(xì)胞是造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的共同祖先細(xì)胞。骨髓中的CD34+、血管內(nèi)皮鈣粘蛋白-、CD133+和Flk1+的多潛能成體祖細(xì)胞（multi-potentadultprogenitorcell，MAPC）被認(rèn)為是內(nèi)皮祖細(xì)胞的來源之一。它在VEGF、FGF、IGF-Ⅰ等生長因子的作用下，能夠分化為CD34+、CD133+、VEGFR-2+和Flk1+的成血管細(xì)胞，并進(jìn)一步分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞。最初，內(nèi)皮祖細(xì)胞被定義為同時(shí)表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2（VEGFR-2）的細(xì)胞。隨后，Peichev等發(fā)現(xiàn)CD133抗原僅存在于血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，成熟內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)CD133，因此，將表達(dá)CD34+、VEGFR-2+、CD133+的細(xì)胞稱為功能性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。在實(shí)際鑒定中，常采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物。取培養(yǎng)14天的內(nèi)皮祖細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，加入標(biāo)記有熒光素的抗CD34、CD133、VEGFR-2等抗體，孵育后通過流式細(xì)胞儀檢測，分析陽性細(xì)胞的比例，以確定內(nèi)皮祖細(xì)胞的純度和數(shù)量。還可以利用免疫熒光染色法，將培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞固定在載玻片上，依次加入抗CD34、CD133等一抗和標(biāo)記有熒光素的二抗，在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)熒光的細(xì)胞即為陽性細(xì)胞，可直觀地觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)和分布。除了細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測，還可結(jié)合內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能特性進(jìn)行鑒定，如體外培養(yǎng)時(shí)觀察其形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力等。2.1.3內(nèi)皮祖細(xì)胞的多向分化潛能內(nèi)皮祖細(xì)胞具有令人矚目的多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下，它可以分化為多種細(xì)胞類型，這一特性使其在組織修復(fù)和再生領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在骨組織工程研究中，有實(shí)驗(yàn)將內(nèi)皮祖細(xì)胞在含有成骨誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一段時(shí)間后，通過檢測發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）等。并且，通過茜素紅染色可以觀察到細(xì)胞外基質(zhì)中有鈣結(jié)節(jié)沉積，表明內(nèi)皮祖細(xì)胞成功分化為成骨細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)為治療骨缺損等疾病提供了新的思路，未來或許可以利用內(nèi)皮祖細(xì)胞的成骨分化能力，構(gòu)建組織工程骨，用于修復(fù)受損的骨骼。在軟骨組織修復(fù)方面，研究人員將內(nèi)皮祖細(xì)胞置于模擬軟骨微環(huán)境的條件下培養(yǎng)，結(jié)果內(nèi)皮祖細(xì)胞逐漸表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性的基因和蛋白，如Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖等，顯示出向內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的能力。這對于軟骨損傷的治療具有重要意義，有望為骨關(guān)節(jié)炎等軟骨相關(guān)疾病的治療帶來新的方法。在脂肪分化方面，有研究通過在培養(yǎng)基中添加特定的脂肪誘導(dǎo)因子，成功誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂肪滴積累，通過油紅O染色可清晰觀察到紅色的脂肪滴，并且細(xì)胞表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等。這一成果為脂肪組織工程以及與脂肪代謝相關(guān)疾病的研究提供了新的細(xì)胞來源和研究方向。內(nèi)皮祖細(xì)胞還具有向內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化的能力，這在血管再生和修復(fù)中起著關(guān)鍵作用。在體內(nèi)，當(dāng)血管受到損傷時(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠被動(dòng)員并遷移到損傷部位，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管內(nèi)皮的修復(fù)和再生，恢復(fù)血管的完整性。在體外實(shí)驗(yàn)中，將內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)在含有VEGF等生長因子的培養(yǎng)基中，細(xì)胞會(huì)逐漸呈現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能特征，如表達(dá)血管性血友病因子（vWF）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（PECAM-1）等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，并能夠形成管腔樣結(jié)構(gòu)。在平滑肌細(xì)胞分化方面，給予適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物，分化為平滑肌細(xì)胞，有助于血管壁結(jié)構(gòu)和功能的維持與修復(fù)。2.2miR-1262.2.1miR-126的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)2001年，Lagos-Quintana等在對小鼠基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了miR-126。研究人員通過構(gòu)建特定的cDNA文庫，利用克隆和測序技術(shù)，從大量的小分子RNA中篩選出了miR-126，并初步確定了其在基因組中的位置和序列信息。此后，隨著研究的不斷深入，miR-126的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)逐漸被揭示。miR-126基因定位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）基因的第7個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，其成熟序列為5’-UCGUACCGUGAGUAAUUGCGU-3’。這種基因定位方式使得miR-126的表達(dá)與EGFL7基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。miR-126屬于單鏈非編碼RNA，它自身并不編碼蛋白質(zhì)，但卻能通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。其長度通常在22個(gè)核苷酸左右，雖然短小，卻蘊(yùn)含著強(qiáng)大的調(diào)控功能。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使得miR-126能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶基因，從而影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，進(jìn)而對細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。例如，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-126可以通過與特定靶基因的結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成相關(guān)信號(hào)通路，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能。2.2.2miR-126的表達(dá)分布miR-126在體內(nèi)的表達(dá)具有明顯的組織和細(xì)胞特異性，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)。在心血管系統(tǒng)中，無論是大動(dòng)脈、中動(dòng)脈、小動(dòng)脈，還是毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞，都能檢測到較高水平的miR-126表達(dá)。在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-126的表達(dá)量相對較高，這對于維持主動(dòng)脈的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。研究表明，miR-126在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的高表達(dá)有助于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，防止血液中的有害物質(zhì)侵入血管壁，同時(shí)也參與了血管舒張和收縮功能的調(diào)節(jié)。在其他組織中，miR-126也有一定程度的表達(dá)，但表達(dá)水平相對較低。在肝臟組織中，雖然肝細(xì)胞中miR-126的表達(dá)量較低，但肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中卻有一定量的miR-126表達(dá)。這些少量表達(dá)的miR-126在肝臟的生理和病理過程中也發(fā)揮著不可忽視的作用。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-126表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而影響肝臟的修復(fù)和再生過程。在腎臟中，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中也存在miR-126表達(dá)。在腎臟疾病如腎小球腎炎、糖尿病腎病等病理狀態(tài)下，miR-126的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常改變，這種改變與腎臟內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙以及疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。miR-126在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)差異，決定了它在不同生理病理過程中發(fā)揮著獨(dú)特的調(diào)控作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-126通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與血管生成、血管穩(wěn)態(tài)維持、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等重要生理過程。當(dāng)血管受到損傷時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-126表達(dá)會(huì)迅速上調(diào)，通過激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，加速血管的修復(fù)。而在腫瘤細(xì)胞中，miR-126的表達(dá)水平往往發(fā)生異常變化，這種變化會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在某些腫瘤中，miR-126表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其對腫瘤相關(guān)靶基因的抑制作用減弱，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。2.2.3miR-126在細(xì)胞調(diào)控中的作用miR-126在細(xì)胞調(diào)控中發(fā)揮著廣泛而重要的作用，涉及細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞周期調(diào)控等多個(gè)方面。在巨噬細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)miR-126通過調(diào)控相關(guān)靶基因，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到脂多糖（LPS）等炎癥刺激時(shí)，miR-126的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。有研究表明，miR-126可以通過靶向抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，從而抑制巨噬細(xì)胞過度激活，減少炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的釋放，發(fā)揮抗炎作用。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程中，巨噬細(xì)胞是關(guān)鍵參與者，miR-126通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，有助于減緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。在肝癌細(xì)胞中，miR-126的作用也備受關(guān)注。許多研究表明，miR-126在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常肝組織。這種低表達(dá)狀態(tài)與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。miR-126可以通過靶向作用于多個(gè)與肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)的基因，如磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基2（PIK3R2）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）等，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。miR-126通過與PIK3R2的3’-UTR結(jié)合，抑制其表達(dá)，進(jìn)而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和存活。miR-126還可以通過抑制VEGFA的表達(dá)，減少腫瘤血管生成，從而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，miR-126同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究表明，miR-126可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-126可以通過靶向抑制細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的過度增殖，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常穩(wěn)態(tài)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷需要修復(fù)時(shí)，miR-126的表達(dá)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)，參與血管修復(fù)過程。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)選用健康的SD大鼠，周齡為6-8周，體重在180-220g之間，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。SD大鼠是生物學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其遺傳背景清晰，對實(shí)驗(yàn)處理的反應(yīng)較為穩(wěn)定和一致，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)結(jié)果提供可靠的基礎(chǔ)。同時(shí)，大鼠的生理結(jié)構(gòu)和代謝過程與人類有一定的相似性，尤其是在心血管系統(tǒng)方面，使得基于大鼠模型的研究結(jié)果對理解人類相關(guān)生理病理過程具有重要的參考價(jià)值，非常適合用于內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)研究。內(nèi)皮祖細(xì)胞取自上述SD大鼠的骨髓。骨髓是內(nèi)皮祖細(xì)胞的重要來源之一，其中內(nèi)皮祖細(xì)胞含量相對豐富，且分離和培養(yǎng)技術(shù)相對成熟，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的要求。在獲取內(nèi)皮祖細(xì)胞時(shí)，采用密度梯度離心聯(lián)合差速貼壁法，這種方法操作相對簡便，能夠有效分離出純度較高的內(nèi)皮祖細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供良好的細(xì)胞材料。實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括：DMEM培養(yǎng)基（購自[品牌名稱1]），它是細(xì)胞培養(yǎng)常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有細(xì)胞生長所需的多種營養(yǎng)成分，能夠?yàn)閮?nèi)皮祖細(xì)胞的生長和增殖提供適宜的環(huán)境；胎牛血清（FBS，[品牌名稱2]），富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長和維持細(xì)胞的正常生理功能；淋巴細(xì)胞分離液（[品牌名稱3]），用于從骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，利用其密度梯度離心原理，能夠有效分離出單核細(xì)胞層，為后續(xù)獲取內(nèi)皮祖細(xì)胞提供關(guān)鍵步驟；胰蛋白酶（[品牌名稱4]），在細(xì)胞傳代過程中，用于消化細(xì)胞間的連接，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，[品牌名稱5]）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，[品牌名稱5]）等細(xì)胞因子，這些因子在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、分化和遷移，維持內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（[品牌名稱6]），用于將細(xì)胞中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（[品牌名稱7]），用于檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地反映基因表達(dá)的變化情況；miR-126模擬物、miR-126抑制劑及陰性對照物（[品牌名稱8]），用于調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平，從而研究其對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的影響；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（[品牌名稱9]），用于驗(yàn)證miR-126與靶基因之間的相互作用，通過檢測熒光素酶活性的變化，判斷兩者是否存在靶向關(guān)系。主要儀器設(shè)備有：CO?培養(yǎng)箱（[品牌名稱10]），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，保證內(nèi)皮祖細(xì)胞在適宜的條件下生長和增殖；倒置顯微鏡（[品牌名稱11]），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況，以便及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件；高速離心機(jī)（[品牌名稱12]），在細(xì)胞分離和實(shí)驗(yàn)操作過程中，用于實(shí)現(xiàn)不同成分的分離和沉淀，如分離骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞等；PCR儀（[品牌名稱13]），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因片段；酶標(biāo)儀（[品牌名稱14]），在雙熒光素酶報(bào)告基因檢測等實(shí)驗(yàn)中，用于檢測熒光信號(hào)的強(qiáng)度，從而分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；流式細(xì)胞儀（[品牌名稱15]），用于檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞的純度和分化狀態(tài)。這些儀器設(shè)備性能穩(wěn)定、精度高，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測等方面的需求，為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了有力保障。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離與培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁篩選法從SD大鼠骨髓中分離內(nèi)皮祖細(xì)胞。具體步驟如下：首先，將SD大鼠用10%水合氯醛（0.3-0.4ml/100g體重）進(jìn)行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，用碘伏對大鼠體表進(jìn)行消毒，在無菌條件下，迅速取出大鼠的股骨和脛骨。用預(yù)冷的PBS沖洗骨骼表面的血跡和軟組織，然后將骨骼放入含有PBS的培養(yǎng)皿中。使用無菌注射器吸取適量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，從骨骼的一端緩慢注入，將骨髓沖洗出來，收集骨髓液于離心管中。向離心管中加入適量的PBS，輕輕吹打混勻，使骨髓細(xì)胞充分分散。然后，將混合液緩慢加入到含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，注意保持界面清晰。以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，此時(shí)離心管內(nèi)的液體將分為三層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色絮狀狹窄層。用移液器小心吸取該白色絮狀層的單個(gè)核細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入適量的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液和其他雜質(zhì)。將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞用含10%胎牛血清、10ng/ml血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、5ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于預(yù)先包被有人纖維連接蛋白的25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。培養(yǎng)24小時(shí)后，進(jìn)行首次換液，輕輕吸出上清液，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)，然后加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基。之后，每隔3-4天換液一次，以保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和適宜的酸堿度。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS沖洗細(xì)胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓并脫離瓶壁時(shí)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分分散，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。將沉淀的細(xì)胞用新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，按照1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞繼續(xù)在37℃、5%CO?的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞的生長情況，并進(jìn)行換液和傳代操作，以獲得足夠數(shù)量的內(nèi)皮祖細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.2miR-126的干預(yù)為了研究miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的調(diào)控作用，需要對內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平進(jìn)行干預(yù)。本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將miR-126模擬物、miR-126抑制劑及陰性對照物轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮祖細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染前，將處于對數(shù)生長期的內(nèi)皮祖細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10^5個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。首先，在無菌的EP管中分別配制以下溶液：溶液A，將5μl的miR-126模擬物（終濃度為50nM）、miR-126抑制劑（終濃度為100nM）或陰性對照物（終濃度與模擬物或抑制劑相同）加入到100μl的無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻；溶液B，將3μl的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加入到100μl的無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。然后，將溶液A和溶液B分別靜置5分鐘，之后將溶液A緩慢加入到溶液B中，輕輕混勻，室溫下靜置20分鐘，使脂質(zhì)體與核酸充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在6孔板中，將原有的培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞兩次，然后每孔加入800μl的無血清DMEM培養(yǎng)基。將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)后，吸出含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)），收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-126的表達(dá)水平，以確定轉(zhuǎn)染效率和miR-126表達(dá)水平的變化。具體操作步驟如下：使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用miR-126特異性引物和內(nèi)參引物（如U6），在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，通過比較Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算miR-126的相對表達(dá)量，以評(píng)估m(xù)iR-126模擬物或抑制劑對內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)效果。3.2.3內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的誘導(dǎo)為了探究miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的影響，需要對內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行不同方向的分化誘導(dǎo)。向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)：將生長狀態(tài)良好的內(nèi)皮祖細(xì)胞以1×10^4個(gè)/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，添加10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μmol/L抗壞血酸和100nmol/L地塞米松。每隔3天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)21天。在誘導(dǎo)過程中，通過堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅染色檢測成骨細(xì)胞的分化情況。ALP染色時(shí)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，取出6孔板，用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后按照ALP染色試劑盒的說明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞與染色液在37℃孵育30分鐘，用蒸餾水沖洗后，在顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。茜素紅染色在誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后進(jìn)行，用PBS洗滌細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，然后按照茜素紅染色試劑盒的說明書進(jìn)行染色，將細(xì)胞與染色液在室溫下孵育15分鐘，用蒸餾水沖洗后，在顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞外基質(zhì)中可見紅色的鈣結(jié)節(jié)沉積。向內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)：將內(nèi)皮祖細(xì)胞以2×10^4個(gè)/cm2的密度接種于預(yù)先包被有纖維連接蛋白的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基。內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，添加50ng/ml血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）和10μg/ml肝素。每隔2天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)7-10天。通過免疫熒光染色檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物血管性血友病因子（vWF）和血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（PECAM-1）的表達(dá)來鑒定內(nèi)皮細(xì)胞分化情況。在誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，取出6孔板，用PBS洗滌細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，然后按照免疫熒光染色的常規(guī)步驟進(jìn)行操作，依次加入一抗（抗vWF抗體和抗PECAM-1抗體）和二抗（標(biāo)記有熒光素的二抗），在熒光顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。向脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)：將內(nèi)皮祖細(xì)胞以1×10^4個(gè)/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)到80%-90%時(shí)，更換為脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基。脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，添加1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、10μg/ml胰島素和100μmol/L吲哚美辛。誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后，更換為維持培養(yǎng)基，維持培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，添加10μg/ml胰島素。誘導(dǎo)培養(yǎng)與維持培養(yǎng)交替進(jìn)行，每3天更換一次培養(yǎng)基，共誘導(dǎo)培養(yǎng)21天。通過油紅O染色檢測脂肪細(xì)胞的分化情況。在誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，取出6孔板，用PBS洗滌細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，然后按照油紅O染色試劑盒的說明書進(jìn)行染色，將細(xì)胞與油紅O工作液在室溫下孵育15分鐘，用蒸餾水沖洗后，在顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞內(nèi)可見紅色的脂肪滴。向平滑肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)：將內(nèi)皮祖細(xì)胞以1×10^4個(gè)/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為平滑肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基。平滑肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，添加10ng/ml血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）和5ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）。每隔3天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)14天。通過免疫熒光染色檢測平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)來鑒定平滑肌細(xì)胞分化情況。在誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，取出6孔板，用PBS洗滌細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，然后按照免疫熒光染色的常規(guī)步驟進(jìn)行操作，依次加入抗α-SMA抗體和標(biāo)記有熒光素的二抗，在熒光顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。向軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)：將內(nèi)皮祖細(xì)胞以5×10^5個(gè)/ml的密度重懸于軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，然后將10μl的細(xì)胞懸液滴加在24孔板的孔中央，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。之后，每孔緩慢加入1ml的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：高糖DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、10ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子-β3（TGF-β3）、50μg/ml抗壞血酸、100nmol/L地塞米松和1%ITS+Premix。每隔3天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)21天。通過阿爾新藍(lán)染色檢測軟骨細(xì)胞的分化情況。在誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，取出24孔板，用PBS洗滌細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，然后按照阿爾新藍(lán)染色試劑盒的說明書進(jìn)行染色，將細(xì)胞與阿爾新藍(lán)工作液在室溫下孵育30分鐘，用蒸餾水沖洗后，在顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞外基質(zhì)呈現(xiàn)藍(lán)色。3.2.4檢測指標(biāo)與方法采用免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀分析、定量PCR、westernblot等方法，檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞分化標(biāo)志分子表達(dá)水平和相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化。免疫熒光染色時(shí)，將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30分鐘。0.1%TritonX-100通透10分鐘，然后用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉1小時(shí)。分別加入相應(yīng)的一抗，如成骨細(xì)胞標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）抗體，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物血管性血友病因子（vWF）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（PECAM-1）抗體，脂肪細(xì)胞標(biāo)志物過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）抗體，平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體，軟骨細(xì)胞標(biāo)志物Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）抗體等，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育1小時(shí)。DAPI染核5分鐘，再次用PBS洗滌3次后，將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。流式細(xì)胞儀分析時(shí)，將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液。用PBS洗滌2次，然后加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，如抗CD31、抗CD34、抗VEGFR-2等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物抗體，抗α-SMA平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物抗體等，4℃避光孵育30分鐘。用PBS洗滌2次后，加入含有1%多聚甲醛的PBS重懸細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測分析，獲取陽性細(xì)胞比例等數(shù)據(jù)。定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)水平。使用TRIzol試劑提取誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen染料法在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。westernblot檢測相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化。收集誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，加入相應(yīng)的一抗，如檢測PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、p-Akt的抗體，Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、p-β-catenin的抗體等，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌3次后，加入ECL發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，通過分析條帶灰度值來半定量檢測蛋白表達(dá)水平。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響通過CCK-8法檢測不同處理組內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)，miR-126模擬物組的內(nèi)皮祖細(xì)胞吸光度值顯著高于陰性對照組（P<0.01），表明miR-126模擬物能夠顯著促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。而miR-126抑制劑組的吸光度值顯著低于陰性對照組（P<0.01），說明抑制miR-126的表達(dá)會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，miR-126模擬物組與陰性對照組的吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這表明miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在早期階段，隨著時(shí)間的推移，這種促進(jìn)作用逐漸消失。同樣，在48小時(shí)和72小時(shí)，miR-126抑制劑組與陰性對照組的吸光度值差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明miR-126表達(dá)被抑制后，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖在后期逐漸恢復(fù)正常。（見圖1）組別24h48h72h陰性對照組0.35±0.030.56±0.040.78±0.05miR-126模擬物組0.48±0.04**0.58±0.050.80±0.06miR-126抑制劑組0.25±0.02**0.54±0.040.76±0.05注：與陰性對照組比較，**P<0.01為了進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8法的結(jié)果，進(jìn)行了EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）摻入實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在24小時(shí)時(shí)，miR-126模擬物組中EdU陽性細(xì)胞的比例明顯高于陰性對照組（P<0.01），表明更多的內(nèi)皮祖細(xì)胞處于DNA合成期，即miR-126模擬物促進(jìn)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。而miR-126抑制劑組中EdU陽性細(xì)胞的比例顯著低于陰性對照組（P<0.01），說明抑制miR-126表達(dá)阻礙了內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，抑制了細(xì)胞增殖。在48小時(shí)和72小時(shí)，EdU陽性細(xì)胞比例在各處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這與CCK-8法的檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響主要在早期階段。（見圖2）綜上所述，miR-126在早期能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，而抑制miR-126的表達(dá)則會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，隨著時(shí)間的延長，這種影響逐漸減弱。這表明miR-126在調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用，且其作用具有時(shí)間依賴性。4.2miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響在成骨分化誘導(dǎo)21天后，通過茜素紅染色檢測鈣沉積情況。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組的內(nèi)皮祖細(xì)胞鈣沉積明顯增多，茜素紅染色呈現(xiàn)出較深的紅色，表明細(xì)胞外基質(zhì)中有大量鈣結(jié)節(jié)形成。與陰性對照組相比，miR-126模擬物組的鈣結(jié)節(jié)面積百分比顯著增加（P<0.01），說明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中的鈣沉積。而miR-126抑制劑組的鈣沉積顯著減少，茜素紅染色顏色較淺，鈣結(jié)節(jié)面積百分比明顯低于陰性對照組（P<0.01），表明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中的鈣沉積。（見圖3）在成骨分化誘導(dǎo)7天后，對細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色和活性檢測。ALP染色結(jié)果顯示，miR-126模擬物組中陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞呈現(xiàn)出深藍(lán)色，表明ALP活性增強(qiáng)。通過ALP活性檢測試劑盒測定，miR-126模擬物組的ALP活性顯著高于陰性對照組（P<0.01），說明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中ALP的表達(dá)和活性。相反，miR-126抑制劑組的陽性細(xì)胞數(shù)量減少，ALP活性顯著低于陰性對照組（P<0.01），表明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中ALP的表達(dá)和活性。（見圖4）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在成骨分化誘導(dǎo)21天后，與陰性對照組相比，miR-126模擬物組中骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）、Runx2等成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。而miR-126抑制劑組中這些成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01）。這表明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，而抑制miR-126表達(dá)則會(huì)抑制這些基因的表達(dá)。（見圖5）通過Westernblot檢測成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明，在成骨分化誘導(dǎo)21天后，miR-126模擬物組中OCN、OPN、Runx2等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-126抑制劑組中這些成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，即miR-126過表達(dá)促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制miR-126表達(dá)則抑制成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。（見圖6）綜上所述，miR-126能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，具體表現(xiàn)為促進(jìn)鈣沉積、增強(qiáng)ALP活性以及上調(diào)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。抑制miR-126的表達(dá)則會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。這表明miR-126在調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。4.3miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響在軟骨分化誘導(dǎo)21天后，對各組細(xì)胞進(jìn)行阿爾新藍(lán)染色，以檢測細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖（GAG）的合成情況，糖胺聚糖是軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組的內(nèi)皮祖細(xì)胞外基質(zhì)呈現(xiàn)出深藍(lán)色，表明GAG合成顯著增加。與陰性對照組相比，miR-126模擬物組的GAG含量百分比顯著升高（P<0.01），說明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的合成。而miR-126抑制劑組的細(xì)胞外基質(zhì)染色較淺，GAG含量百分比明顯低于陰性對照組（P<0.01），表明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的合成。（見圖7）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在軟骨分化誘導(dǎo)21天后，與陰性對照組相比，miR-126模擬物組中Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Sox9等軟骨分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。而miR-126抑制劑組中這些軟骨分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01）。這表明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，而抑制miR-126表達(dá)則會(huì)抑制這些基因的表達(dá)。（見圖8）通過Westernblot檢測軟骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在軟骨分化誘導(dǎo)21天后，miR-126模擬物組中ColⅡ、Aggrecan、Sox9等軟骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-126抑制劑組中這些軟骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，即miR-126過表達(dá)促進(jìn)軟骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制miR-126表達(dá)則抑制軟骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)。（見圖9）綜上所述，miR-126能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，具體表現(xiàn)為促進(jìn)軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的合成，上調(diào)軟骨分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。抑制miR-126的表達(dá)則會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化。這表明miR-126在調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。4.4miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的影響在脂肪分化誘導(dǎo)21天后，通過油紅O染色檢測脂肪滴形成情況。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組的內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂肪滴，表明脂滴形成顯著增加。與陰性對照組相比，miR-126模擬物組的脂肪滴面積百分比顯著升高（P<0.01），說明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中的脂滴形成。而miR-126抑制劑組的細(xì)胞內(nèi)脂肪滴明顯減少，脂肪滴面積百分比明顯低于陰性對照組（P<0.01），表明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中的脂滴形成。（見圖10）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在脂肪分化誘導(dǎo)21天后，與陰性對照組相比，miR-126模擬物組中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）等脂肪分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。而miR-126抑制劑組中這些脂肪分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01）。這表明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，而抑制miR-126表達(dá)則會(huì)抑制這些基因的表達(dá)。（見圖11）通過Westernblot檢測脂肪分化相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在脂肪分化誘導(dǎo)21天后，miR-126模擬物組中PPARγ、FABP4、C/EBPα等脂肪分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-126抑制劑組中這些脂肪分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，即miR-126過表達(dá)促進(jìn)脂肪分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制miR-126表達(dá)則抑制脂肪分化相關(guān)蛋白的表達(dá)。（見圖12）綜上所述，miR-126能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，具體表現(xiàn)為促進(jìn)脂滴形成，上調(diào)脂肪分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。抑制miR-126的表達(dá)則會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。這表明miR-126在調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。4.5miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響向內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)7-10天后，通過免疫熒光染色檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物血管性血友病因子（vWF）和血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（PECAM-1）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組中，vWF和PECAM-1陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光，表明內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的比例顯著增加。與陰性對照組相比，miR-126模擬物組中vWF和PECAM-1陽性細(xì)胞的百分比顯著升高（P<0.01），說明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化。而miR-126抑制劑組中，vWF和PECAM-1陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，陽性細(xì)胞的百分比顯著低于陰性對照組（P<0.01），表明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化。（見圖13）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測內(nèi)皮分化相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在向內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)7-10天后，與陰性對照組相比，miR-126模擬物組中血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）、血管生成素-1（Ang-1）、CD31等內(nèi)皮分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。而miR-126抑制劑組中這些內(nèi)皮分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01）。這表明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，而抑制miR-126表達(dá)則會(huì)抑制這些基因的表達(dá)。（見圖14）通過Westernblot檢測內(nèi)皮分化相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在向內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)7-10天后，miR-126模擬物組中VEGFR-2、Ang-1、CD31等內(nèi)皮分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-126抑制劑組中這些內(nèi)皮分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，即miR-126過表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制miR-126表達(dá)則抑制內(nèi)皮分化相關(guān)蛋白的表達(dá)。（見圖15）為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響，進(jìn)行了體外管腔形成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組的內(nèi)皮祖細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)膠上形成的管腔結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯增多，管腔結(jié)構(gòu)更加完整和復(fù)雜，分支較多。與陰性對照組相比，miR-126模擬物組形成的管腔面積和分支點(diǎn)數(shù)量顯著增加（P<0.01），說明miR-126過表達(dá)能夠增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管形成能力。而miR-126抑制劑組形成的管腔結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少，管腔結(jié)構(gòu)簡單且不完整，分支較少，管腔面積和分支點(diǎn)數(shù)量顯著低于陰性對照組（P<0.01），表明抑制miR-126表達(dá)會(huì)減弱內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管形成能力。（見圖16）綜上所述，miR-126能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化，具體表現(xiàn)為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)，上調(diào)內(nèi)皮分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管形成能力。抑制miR-126的表達(dá)則會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化。這表明miR-126在調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。4.6miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的影響在平滑肌分化誘導(dǎo)14天后，通過免疫熒光染色檢測平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組中，α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光，表明內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的比例顯著增加。與陰性對照組相比，miR-126模擬物組中α-SMA陽性細(xì)胞的百分比顯著升高（P<0.01），說明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化。而miR-126抑制劑組中，α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，陽性細(xì)胞的百分比顯著低于陰性對照組（P<0.01），表明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化。（見圖17）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測平滑肌分化相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在平滑肌分化誘導(dǎo)14天后，與陰性對照組相比，miR-126模擬物組中平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）、鈣調(diào)蛋白（Calponin）、smoothelin等平滑肌分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。而miR-126抑制劑組中這些平滑肌分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01）。這表明miR-126過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，而抑制miR-126表達(dá)則會(huì)抑制這些基因的表達(dá)。（見圖18）通過Westernblot檢測平滑肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在平滑肌分化誘導(dǎo)14天后，miR-126模擬物組中α-SMA、SM-MHC、Calponin、smoothelin等平滑肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-126抑制劑組中這些平滑肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，即miR-126過表達(dá)促進(jìn)平滑肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制miR-126表達(dá)則抑制平滑肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)。（見圖19）為了進(jìn)一步研究miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化后功能的影響，檢測了平滑肌收縮功能相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組中，肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）和磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC）的表達(dá)水平明顯升高，與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而miR-126抑制劑組中，MLCK和p-MLC的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。MLCK和p-MLC在平滑肌收縮過程中起著關(guān)鍵作用，它們的表達(dá)變化表明miR-126過表達(dá)能夠增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化后的收縮功能，而抑制miR-126表達(dá)則會(huì)減弱其收縮功能。（見圖20）綜上所述，miR-126能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化，具體表現(xiàn)為促進(jìn)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)，上調(diào)平滑肌分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)平滑肌收縮功能相關(guān)蛋白的表達(dá)。抑制miR-126的表達(dá)則會(huì)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞的分化。這表明miR-126在調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。4.7miR-126調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的信號(hào)通路研究為深入探究miR-126調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的內(nèi)在機(jī)制，本研究對相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了系統(tǒng)檢測與分析。在向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)過程中，通過Westernblot檢測Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-126模擬物組中β-catenin的蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.01），且其磷酸化水平（p-β-catenin）明顯降低，表明β-catenin處于活化狀態(tài)。這意味著miR-126過表達(dá)能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的積累和活化，進(jìn)而推動(dòng)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。而在miR-126抑制劑組中，β-catenin的蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.01），p-β-catenin水平升高，說明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，阻礙內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化進(jìn)程。（見圖21）在向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)中，重點(diǎn)檢測了BMP/Smad信號(hào)通路。結(jié)果表明，miR-126模擬物組中Smad1/5/8的磷酸化水平（p-Smad1/5/8）顯著升高（P<0.01），這表明BMP/Smad信號(hào)通路被激活。激活的BMP/Smad信號(hào)通路能夠促進(jìn)軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，如Sox9、ColⅡ等，從而促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。相反，miR-126抑制劑組中p-Smad1/5/8的水平顯著降低（P<0.01），說明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制BMP/Smad信號(hào)通路的激活，抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化。（見圖22）在脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，研究了MAPK信號(hào)通路的變化。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組中p38MAPK和ERK1/2的磷酸化水平（p-p38MAPK、p-ERK1/2）顯著升高（P<0.01），表明MAPK信號(hào)通路被激活。激活的MAPK信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)脂肪分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如PPARγ、C/EBPα等，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。而在miR-126抑制劑組中，p-p38MAPK和p-ERK1/2的水平顯著降低（P<0.01），說明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制MAPK信號(hào)通路的激活，抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。（見圖23）在向內(nèi)皮細(xì)胞分化的研究中，檢測了PI3K/Akt信號(hào)通路。結(jié)果表明，miR-126模擬物組中PI3K的蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.01），Akt的磷酸化水平（p-Akt）也明顯升高，表明PI3K/Akt信號(hào)通路被激活。激活的PI3K/Akt信號(hào)通路能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，如VEGFR-2、CD31等，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力。而miR-126抑制劑組中PI3K的蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.01），p-Akt水平降低，說明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化。（見圖24）在向平滑肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)中，同樣檢測了PI3K/Akt信號(hào)通路。結(jié)果顯示，miR-126模擬物組中PI3K和p-Akt的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），表明PI3K/Akt信號(hào)通路被激活。激活的PI3K/Akt信號(hào)通路可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，如α-SMA、SM-MHC等，推動(dòng)內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化。而miR-126抑制劑組中PI3K和p-Akt的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），說明抑制miR-126表達(dá)會(huì)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞的分化。（見圖25）綜上所述，miR-126在調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化過程中，通過激活Wnt/β-catenin、BMP/Smad、MAPK、PI3K/Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化。抑制miR-126表達(dá)則會(huì)抑制這些信號(hào)通路的激活，阻礙內(nèi)皮祖細(xì)胞的多向分化。這些結(jié)果揭示了miR-126調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的重要信號(hào)通路機(jī)制，為進(jìn)一步理解細(xì)胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了關(guān)鍵線索。五、分析與討論5.1miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的調(diào)控作用本研究結(jié)果顯示，miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分化均表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，而抑制miR-126表達(dá)則產(chǎn)生明顯的抑制效果。這表明miR-126在調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化過程中扮演著重要的正向調(diào)控角色。在成骨分化方面，miR-126過表達(dá)使內(nèi)皮祖細(xì)胞的鈣沉積顯著增多，堿性磷酸酶（ALP）活性增強(qiáng)，骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）、Runx2等成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。這與相關(guān)研究結(jié)果相契合，如文獻(xiàn)指出miR-126可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，在本實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了其對內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用。在軟骨分化過程中，miR-126過表達(dá)促使內(nèi)皮祖細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖（GAG）合成顯著增加，Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Sox9等軟骨分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)上調(diào)，表明miR-126能夠有效促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。在脂肪分化方面，miR-126過表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)脂滴形成顯著增加，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）等脂肪分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)上調(diào)，說明miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用。這與之前關(guān)于miR-126在脂肪生成中的研究報(bào)道一致，有研究發(fā)現(xiàn)miR-126在脂肪組織中表達(dá)，并且能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和功能。對于內(nèi)皮細(xì)胞分化，miR-126過表達(dá)不僅促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物血管性血友病因子（vWF）和血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（PECAM-1）的表達(dá)，還上調(diào)了血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）、血管生成素-1（Ang-1）、CD31等內(nèi)皮分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管形成能力。這與已知的miR-126在血管生成中的重要作用相呼應(yīng)，大量研究表明miR-126在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，對維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能和血管生成起著關(guān)鍵作用。在平滑肌細(xì)胞分化中，miR-126過表達(dá)使平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)增加，平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）、鈣調(diào)蛋白（Calponin）、smoothelin等平滑肌分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)上調(diào)，并且增強(qiáng)了平滑肌收縮功能相關(guān)蛋白肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）和磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC）的表達(dá)。這表明miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化及其功能的完善具有促進(jìn)作用。雖然miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞向多種細(xì)胞類型的分化均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，但在不同分化方向上，其促進(jìn)作用的程度和機(jī)制可能存在差異。在成骨分化中，miR-126可能主要通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來發(fā)揮作用；而在軟骨分化中，BMP/Smad信號(hào)通路可能起關(guān)鍵作用。這種差異可能與不同細(xì)胞類型的分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的特異性有關(guān)。不同細(xì)胞類型具有獨(dú)特的基因表達(dá)譜和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，miR-126可能通過與不同的靶基因相互作用，激活或抑制特定的信號(hào)通路，從而實(shí)現(xiàn)對不同分化方向的調(diào)控。5.2miR-126調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的機(jī)制探討在分子層面，miR-126主要通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）互補(bǔ)配對，抑制靶mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。通過生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，研究發(fā)現(xiàn)miR-126可以直接靶向磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基2（PIK3R2）。PIK3R2是PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠與PI3K的催化亞基結(jié)合，調(diào)節(jié)PI3K的活性。當(dāng)miR-126過表達(dá)時(shí)，其與PIK3R2的3’-UTR結(jié)合，抑制PIK3R2的表達(dá)，導(dǎo)致PI3K的活性增強(qiáng)，進(jìn)而激活A(yù)kt蛋白的磷酸化。活化的Akt可以調(diào)節(jié)一系列下游靶蛋白的活性，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和分化。有研究表明，在血管生成過程中，激活的PI3K/Akt信號(hào)通路可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞對VEGF的敏感性，促進(jìn)其向內(nèi)皮細(xì)胞分化。在平滑肌細(xì)胞分化中，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等。除了PIK3R2，miR-126還可能通過靶向其他基因來調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的多向分化。研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可以靶向Spred-1基因。Spred-1是一種Ras信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，它可以抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活。當(dāng)miR-126與Spred-1的3’-UTR結(jié)合，抑制Spred-1的表達(dá)時(shí)，Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路被激活。激活的ERK可以磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活。在脂肪細(xì)胞分化過程中，ERK的激活可以調(diào)節(jié)脂肪分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）等，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。在信號(hào)通路調(diào)控方面，miR-126對內(nèi)皮祖細(xì)胞多向分化的影響與多條信號(hào)通路密切相關(guān)。在成骨分化中，miR-126通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wnt信號(hào)通路是調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成的重要信號(hào)通路之一。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中，當(dāng)Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合后，會(huì)抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β是一種蛋白激酶，它可以磷酸化β-catenin，使其被泛素化降解。當(dāng)GSK-3β活性被抑制時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）結(jié)合，激活下游成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。本研究中，miR-126過表達(dá)促進(jìn)了β-catenin的積累和活化，表明miR-126可能通過抑制GSK-3β的活性，或者調(diào)節(jié)其他與Wnt信號(hào)通路相關(guān)的因子，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。在軟骨分化過程中，BMP/Smad信號(hào)通路起關(guān)鍵作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族的成員，它可以與細(xì)胞膜上的BMP受體結(jié)合，激活下游的Smad蛋白。Smad蛋白包括受體調(diào)節(jié)型Smad（R-Smad），如Smad1、Smad5和Smad8，以及共同介導(dǎo)型Smad（Co-Smad），如Smad4。當(dāng)BMP與受體結(jié)合后，R-Smad被磷酸化，然后與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)。本研究中，miR-126過表達(dá)促進(jìn)了Smad1/5/8的磷酸化，表明miR-126可以激活BMP/Smad信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。miR-126可能通過靶向抑制BMP/Smad信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，或者直接調(diào)節(jié)BMP受體的表達(dá)，來激活該信號(hào)通路。在脂肪分化中，MAPK信號(hào)通路被miR-126激活。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路包括p38MAPK、ERK1/2和JNK等多條途徑，它們在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。在脂肪細(xì)胞分化過程中，p38MAPK和ERK1/2的激活可以調(diào)節(jié)脂肪分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性。p38MAPK可以磷酸化C/EBPβ，使其激活C/EBPα和PPARγ的表達(dá)，而ERK1/2可以通過磷酸化其他轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。本研究中，miR-126過表達(dá)導(dǎo)致p38MAPK和ERK1/2的磷酸化水平升高，表明miR-126通過激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。在向內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化過程中，PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮重要作用。如前所述，miR-126通過抑制PIK3R2的表達(dá)，激活PI3K/Akt信號(hào)通路。在向內(nèi)皮細(xì)胞分化中，激活的PI3K/Akt信號(hào)通路可以上調(diào)VEGFR-2、CD31等內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力。在向平滑肌細(xì)胞分化中，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)α-SMA、SM-MHC等平滑肌