張雨微豬生長抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備

序號：編碼：“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術(shù)科技作品競賽決賽作品申報書作品名稱：豬生長抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備所在學院：動物科學學院申報者姓名（集體名稱）：張雨微類別：□√自然科學類學術(shù)論文□哲學社會科學類社會調(diào)查報告和學術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類

A1．申報者情況（個人項目）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫，申報者情況欄內(nèi)必須填寫個人作品的第一作者（承擔申報作品60%以上的工作者）；2．本表中的學籍管理部門簽章視為對申報者情況的確認。申報者情況姓名張雨微性別女出生年月1988年5月所在學院動物科學學院專業(yè)動物生物技術(shù)現(xiàn)學歷本科年級三學制四年入學時間2006年9月作品全稱豬生長抑素(SS)RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備畢業(yè)論文題目通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學華山學生宿舍23棟505郵政編碼510640單位電話常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學華山學生宿舍23棟505郵政編碼510640住宅電話02087344523合作者情況姓名性別年齡學歷所在單位葉康男21本科華南農(nóng)業(yè)大學朱俊女21本科華南農(nóng)業(yè)大學資格認定學院學籍管理部門意見□是□否若是，其學號為：（學院蓋章）年月日院系負責人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學術(shù)科技或社會實踐活動成果。□是□否負責人簽名：年月日

B1．申報作品情況（自然科學類學術(shù)論文）說明：1．必須由申報者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內(nèi)容的確認；3．作品分類請按作品的學術(shù)方向或所涉及的主要學科領(lǐng)域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱豬生長抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．數(shù)理（包括數(shù)學、物理、地球與空間科學等）D．生命科學（包括生物、農(nóng)學、藥學、醫(yī)學、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路SS于1972年首次發(fā)現(xiàn)能抑制GH的分泌，目前在生產(chǎn)上采取降低SS水平，解除SS對GH、IGF－I等的抑制，達到促進動物生長的目的。隨著胚胎技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在動物整體水平上敲除或沉默目的基因或?qū)胪庠椿蚋牧紕游锏纳a(chǎn)性能已得到了廣泛的研究與應(yīng)用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達水平可長久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉(zhuǎn)基因動物。本實驗在已有研究的基礎(chǔ)上，擬選擇在動物生長調(diào)控中起重要作用的負調(diào)節(jié)因子生長抑素（SS）作為靶基因，制備最優(yōu)RNAi效應(yīng)的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因動物，并為研究動物生長調(diào)控提供有益的動物模型。作品的科學性、先進性及獨特之處（1）在方法上創(chuàng)新性為動物整體水平上緘默SS基因表達提供優(yōu)良RNAi效應(yīng)的shRNA序列；（2）在思路上前沿性提出利用慢病毒載體與RNAi技術(shù)相結(jié)合廉價，為快速生產(chǎn)SS基因部分緘默的轉(zhuǎn)基因動物模型奠定一定的實驗基礎(chǔ)。作品的實際應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義本實驗選擇在動物生長調(diào)控中起重要作用的負調(diào)節(jié)因子生長抑素（SS）作為靶基因，制備最優(yōu)RNAi效應(yīng)的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因動物，為畜牧業(yè)動物育種改良可提供良好的經(jīng)濟利益和社會效益，也為這項技術(shù)早日進入實際應(yīng)用打下基礎(chǔ)，并可為研究動物生長調(diào)控提供有益的動物模型。學術(shù)論文文摘生長抑素SS是動物生長激素GH釋放的負性因子，其在血液中濃度下降（如免疫中和）能間接促進動物生長、提高動物的生產(chǎn)性能。下調(diào)SS基因的表達成了改良動物生長性能的方法。我們用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在動物體內(nèi)表達SSHBsAg融合蛋白產(chǎn)生中和抗體得到促生長效果。RNAi緘默靶基因的表達在多種生物體內(nèi)獲得成功應(yīng)用。shRNA是模仿體內(nèi)miRNA的結(jié)構(gòu)而構(gòu)建的能在細胞內(nèi)表達的短發(fā)夾RNA，引起特異的RNAi效應(yīng)。慢病毒載體能感染分裂細胞也能感染靜止細胞，有很強的感染和整合能力，是目前應(yīng)用前景廣泛的一種基因轉(zhuǎn)移載體。本研究在以往工作基礎(chǔ)上，結(jié)合RNAi和慢病毒載體技術(shù)，設(shè)計和篩選產(chǎn)生SS靶基因RNAi效應(yīng)的shRNA表達序列，以便通過慢病毒載體的介導(dǎo)下整合到動物胚胎細胞染色體上，生產(chǎn)出攜帶SSshRNA的轉(zhuǎn)基因動物。通過RNAi效應(yīng)在動物整體水平上緘默SS的表達，從遺傳改造的角度達到提高動物生長性能的目的。為提高畜牧業(yè)動物生產(chǎn)性能打下理論和實踐的基礎(chǔ)，同時為動物生長調(diào)節(jié)的研究建立良好動物模型。作品在何時、何地、何種機構(gòu)舉行的會議上或報刊上發(fā)表及所獲獎勵2008年中國畜牧獸醫(yī)學會動物生理生化學分會（西安.楊凌）《畜牧與獸醫(yī)》增刊：《慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾生長抑素表達下調(diào)及轉(zhuǎn)基因動物模型的建立》鑒定結(jié)果無請?zhí)峁τ诶斫狻彶椤⒃u價所申報作品具有參考價值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻的檢索目錄SS基因RNAi干涉效果的篩選慢病毒載體的制備申報材料清單（申報論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）動物的生產(chǎn)性能是畜牧業(yè)發(fā)展過程中的重要經(jīng)濟性狀，生長抑素(SSI)是抑制動物生長的主要因素。SST主動免疫和添加SST抑制劑雖然取得了一定的效果但是仍不理想，而傳統(tǒng)的育種方法在改善動物的生長性能方面進程非常緩慢，因而探索探索新的方法和技術(shù)十分必要。RNAi是下調(diào)靶基因的有效方法，慢病毒載體也是目前應(yīng)用前景最廣泛的基因轉(zhuǎn)移載體，本試驗根據(jù)靶基因SST設(shè)計和篩選出了最優(yōu)RNAi效應(yīng)的靶基因shRNA序列，并已成功構(gòu)建到慢病毒載體上，通過慢病毒載體和精原干細胞介導(dǎo)聯(lián)合制備出穩(wěn)定表達靶基因shRNA的可遺傳的轉(zhuǎn)基因動物，利用RNAi效應(yīng)在動物整體水平上下調(diào)SST的表達，從而到達提高動物生產(chǎn)性能的目的。科研管理部門簽章年月日C.當前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。（1）生長抑素對生長激素分泌的負調(diào)控生長激素（growthhormone,GH）是調(diào)節(jié)動物和人生長的主要激素，由垂體分泌，主要受下丘腦分泌的正性調(diào)控因子即生長激素釋放因子（growthhormonereleasingfactor,GRF）或稱生長激素釋放激素（growthhormonereleasinghormone,GHRH）和負性調(diào)控因子即生長激素釋放抑制激素（somatostatin,SS）或簡稱生長抑素的雙向調(diào)節(jié)。研究表明SS能抑制腦垂體細胞的cAMP生成，提高cGMP濃度，抑制GH的合成與釋放，降低血液GH濃度。同時SS還能調(diào)節(jié)GRF的釋放，影響GRF基因的表達，通過拮抗GRF的作用以協(xié)同控制GH的水平。（2）生長抑素在動物促生長領(lǐng)域的應(yīng)用GH的水平影響骨、軟骨的生長以及肌蛋白的合成與沉積等，從而影響動物和人的生長狀況。在生產(chǎn)應(yīng)用上GH具有促生長，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等方面的作用，有著廣泛的經(jīng)濟價值和社會效益。生長抑素（SS）通過抑制垂體分泌GH，從而降低GH水平。目前在生產(chǎn)上采取降低SS水平，解除SS對GH、IGF－I等的抑制，達到促進動物生長的目的，如主動免疫技術(shù)。隨著胚胎技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在動物整體水平上敲除或沉默目的基因或?qū)胪庠椿蚋牧紕游锏纳a(chǎn)性能已得到了廣泛的研究與應(yīng)用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達水平可長久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉(zhuǎn)基因動物。（3）RNAi技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動物RNAi（RNAinterference）稱為RNA干涉，通過雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)與之同源的mRNA降解，導(dǎo)致目標基因轉(zhuǎn)錄后緘默（posttranscriptionalgenesilencing,PTGS）的現(xiàn)象或機制。在動物機體中，有兩種小分子RNA能介導(dǎo)這種現(xiàn)象的發(fā)生，microRNA(miRNA)和siRNA。前者形成分子內(nèi)雙鏈RNA，后者形成分子間雙鏈RNA，兩者雙鏈RNA在細胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)Dicer酶切割成長度約為21~25個nt片段，即小分子雙鏈RNA。在解旋酶(helicase)的作用下解開雙鏈RNA，其中僅保留一條RNA鏈與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNAinducedsilencingplex,RISC)結(jié)合，根據(jù)堿基互補配對原則識別靶mRNA，引起靶mRNA被剪切降解或翻譯的抑制。2002年，Hasuwa等人成功地建立了第一例應(yīng)用RNAi的轉(zhuǎn)基因小鼠。幾乎同時多數(shù)研究者們利用RNA聚合酶III的啟動子構(gòu)建shRNA的載體應(yīng)用于轉(zhuǎn)染哺乳動物的細胞系，結(jié)果對靶基因均產(chǎn)生了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄后緘默效果，表達下降90%以上。2006年Dann等人通過慢病毒介導(dǎo)RNAi敲除了大鼠上的Dazal基因，構(gòu)建了兩條shRNA序列（pLLU2GDazl1和pLLU2GDazl2），結(jié)果這兩條轉(zhuǎn)基因序列對靶基因Dazal的表達均產(chǎn)生了幾乎完全的抑制，并在后代中獲得了穩(wěn)定的可遺傳的DazlshRNA轉(zhuǎn)基因大鼠。shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠的出現(xiàn)使得RNAi技術(shù)在哺乳動物整體水平上進行靶基因的敲低或緘默成為可能。研究表明與建立在胚胎干細胞和同源重組技術(shù)上的基因敲除相比，用RNAi技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因動物無論是時間上還是在效率上都有著很大的優(yōu)勢。（4）慢病毒載體的特點與構(gòu)建慢病毒（lentivirus）是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，引起慢性感染得名。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比不僅感染分裂細胞、也感染非分裂細胞，即靜止細胞如神經(jīng)細胞、巨嗜細胞、造血干細胞和肌肉細胞等，大大提高了感染效率，感染之后能高效整合和表達目的基因。用慢病毒載體感染動物卵母細胞和胚胎細胞能有效構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物。Hofmann等用含GFP目的基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染豬胚胎，產(chǎn)下46只小豬中，有32只攜帶GFP基因，其中30只能表達GFP。同時用該載體轉(zhuǎn)染牛的卵母細胞時也獲得了GFP高表達率。慢病毒載體（lentiviralvector,LV）的構(gòu)建原理是將HIV1基因組中的順式作用元件（如包裝信號和長末端重復(fù)序列）和編碼反式作用蛋白的序列分離。載體系統(tǒng)分成包裝部分和載體部分，其中包裝部分由去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列構(gòu)成，僅提供病毒包裝所需蛋白；載體部分與包裝部分互補，含包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需順式作用序列。（5）慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用慢病毒載體（LV）于1996年發(fā)展以來只是用于細胞轉(zhuǎn)染和基因治療的研究，但直到2002年Lois等將其用于轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠的制備，之后LV在制備轉(zhuǎn)基因動物上獲得極大的發(fā)展與應(yīng)用。與顯微注射法相比，免去了操作困難、效率低下和成本過高的缺點。LV法相對操作簡單、整合能力強，通過感染早期胚胎或受精卵細胞即可獲得轉(zhuǎn)基因胚胎。由于LV的高效率感染和在宿主細胞DNA上的高度整合特性，可以大大提高外源基因的轉(zhuǎn)移效率。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認。推薦者情況姓名張永亮性別男年齡42職稱教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院通訊地址廣州市天河區(qū)五山郵政編碼510642單位電話02085281269住宅電話推薦者所在單位簽章（簽章）年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述申報內(nèi)容真實可信，已有一定的實驗基礎(chǔ)請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價該作品具有一定的科學研究價值，研究手段較先進，方向前沿，條件具備，所獲成果有較好的示范和推廣前景。其它說明推薦者情況姓名習欠云性別男年齡36職稱講師工作單位華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院通訊地址廣州市天河區(qū)五山郵編510642單位電話02085285469住宅電話推薦者所在單位簽章簽章日期年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述情況屬實，同意推薦請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價該作品具備較好的前期基礎(chǔ)，技術(shù)路線明確，方法手段先進，實驗條件具備，所獲轉(zhuǎn)基因動物具備良好的推廣前景，所獲慢病毒是一種廣泛應(yīng)用的基因轉(zhuǎn)移載體，值得進一步的推廣與應(yīng)用。其它說明豬生長抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備張雨微葉康朱俊指導(dǎo)老師：張永亮習欠云作者單位：華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州，510640摘要：動物的生產(chǎn)性能是畜牧業(yè)發(fā)展過程中的重要經(jīng)濟性狀，生長抑素(SSI)是抑制動物生長的主要因素。SST主動免疫和添加SST抑制劑雖然取得了一定的效果但是仍不理想，而傳統(tǒng)的育種方法在改善動物的生長性能方面進程非常緩慢，因而探索探索新的方法和技術(shù)十分必要。RNAi是下調(diào)靶基因的有效方法，慢病毒載體也是目前應(yīng)用前景最廣泛的基因轉(zhuǎn)移載體，本試驗根據(jù)靶基因SST設(shè)計和篩選出了最優(yōu)RNAi效應(yīng)的靶基因shRNA序列，并已成功構(gòu)建到慢病毒載體上，通過慢病毒載體和精原干細胞介導(dǎo)聯(lián)合制備出穩(wěn)定表達靶基因shRNA的可遺傳的轉(zhuǎn)基因動物，利用RNAi效應(yīng)在動物整體水平上下調(diào)SST的表達，從而到達提高動物生產(chǎn)性能的目的。關(guān)鍵詞：生長抑素RNAi效應(yīng)假型慢病毒正文：1引言1.1生長抑素對動物生長的抑制作用：動物生長的過程受很多激素調(diào)節(jié)，其中生長激素（GH，GrowthHormone）是調(diào)節(jié)動物生長的核心之一。而GH的釋放又主要受正負兩種因子調(diào)控，其中正性調(diào)控因子生長激素釋放因子(GRF，GrowthHormoneReleasingFactor；SRF，SomatotrophinReleasingFactor)又稱生長激素釋放激素(GHRH，GrowthHormoneReleasingHormone)是存在于人和動物體內(nèi)的一種生物活性物質(zhì)，主要由下丘腦合成并分泌，能特異的誘導(dǎo)生長激素的合成與分泌；負調(diào)控因子生長激素釋放抑制因子(SS，SomatostatinorGHRIH，GrowthHormoneReleaseinhibitingHormone)又稱生長抑素，與GRF一起，調(diào)節(jié)人和動物體內(nèi)生長激素的濃度。SS于1972年首次發(fā)現(xiàn)能抑制GH的分泌，目前在生產(chǎn)上采取降低SS水平，解除SS對GH、IGF－I等的抑制，達到促進動物生長的目的。通過人工調(diào)控GRF、SS濃度的方法來促進動物的生長，提高生產(chǎn)性能是目前研究的熱點。隨著胚胎技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在動物整體水平上敲除或沉默目的基因或?qū)胪庠椿蚋牧紕游锏纳a(chǎn)性能已得到了廣泛的研究與應(yīng)用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達水平可長久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉(zhuǎn)基因動物。1.2RNA干涉技術(shù)近年來的研究表明，一些短片斷的雙鏈RNA（dsRNA）可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi，RNAinterference）。因此，RNAi是dsRNA介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)（PTGS，posttranscriptionalgenesilencing）。小干擾RNA（siRNA，smallinterferingribonucleicacid）就是這種短片斷dsRNA分子，能夠以序列同源互補的mRNA為靶目標，降解特定的mRNA。RNAi具有高度特異性、高沉默效率、廣抑制范圍、高度穩(wěn)定性以及操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點。siRNA作用與應(yīng)用研究自2001年以來，連續(xù)被美國《Science》雜志評選為年度十大科技突破之一。RNAi技術(shù)被廣泛應(yīng)用到包括功能基因組學，藥物靶點篩選，細胞信號傳導(dǎo)通路分析，疾病治療等等；RNAi技術(shù)也已經(jīng)迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能研究、基因表達調(diào)控機制研究等熱門領(lǐng)域。由于siRNA在哺乳動物細胞中可以誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)，現(xiàn)也被廣泛用來抑制特定基因的表達。選擇在動物生長調(diào)控中起重要作用的負調(diào)節(jié)因子生長抑素（SS）作為靶基因，制備最優(yōu)RNAi效應(yīng)的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因動物，為畜牧業(yè)動物育種改良可提供良好的經(jīng)濟利益和社會效益，也為這項技術(shù)早日進入實際應(yīng)用打下基礎(chǔ)，并可為研究動物生長調(diào)控提供有益的動物模型。本實驗技術(shù)技術(shù)在方法上創(chuàng)新性為動物整體水平上緘默SS基因表達提供優(yōu)良RNAi效應(yīng)的shRNA序列；在思路上前沿性提出利用慢病毒載體與RNAi技術(shù)相結(jié)合廉價，為快速生產(chǎn)SS基因部分緘默的轉(zhuǎn)基因動物模型奠定一定的實驗基礎(chǔ)。生長抑素SS是動物生長激素GH釋放的負性因子，其在血液中濃度下降（如免疫中和）能間接促進動物生長、提高動物的生產(chǎn)性能。下調(diào)SS基因的表達成了改良動物生長性能的方法。我們用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在動物體內(nèi)表達SSHBsAg融合蛋白產(chǎn)生中和抗體得到促生長效果。RNAi緘默靶基因的表達在多種生物體內(nèi)獲得成功應(yīng)用。shRNA是模仿體內(nèi)miRNA的結(jié)構(gòu)而構(gòu)建的能在細胞內(nèi)表達的短發(fā)夾RNA，引起特異的RNAi效應(yīng)。慢病毒載體能感染分裂細胞也能感染靜止細胞，有很強的感染和整合能力，是目前應(yīng)用前景廣泛的一種基因轉(zhuǎn)移載體。本研究在以往工作基礎(chǔ)上，結(jié)合RNAi和慢病毒載體技術(shù)，設(shè)計和篩選產(chǎn)生SS靶基因RNAi效應(yīng)的shRNA表達序列，以便通過慢病毒載體的介導(dǎo)下整合到動物胚胎細胞染色體上，生產(chǎn)出攜帶SSshRNA的轉(zhuǎn)基因動物。通過RNAi效應(yīng)在動物整體水平上緘默SS的表達，從遺傳改造的角度達到提高動物生長性能的目的。為提高畜牧業(yè)動物生產(chǎn)性能打下理論和實踐的基礎(chǔ)，同時為動物生長調(diào)節(jié)的研究建立良好動物模型。1.3國內(nèi)外同類課題研究水平的應(yīng)用和發(fā)展（1）生長抑素對生長激素分泌的負調(diào)控：生長激素（growthhormone,GH）是調(diào)節(jié)動物和人生長的主要激素，由垂體分泌，主要受下丘腦分泌的正性調(diào)控因子即生長激素釋放因子（growthhormonereleasingfactor,GRF）或稱生長激素釋放激素（growthhormonereleasinghormone,GHRH）和負性調(diào)控因子即生長激素釋放抑制激素（somatostatin,SS）或簡稱生長抑素的雙向調(diào)節(jié)。研究表明SS能抑制腦垂體細胞的cAMP生成，提高cGMP濃度，抑制GH的合成與釋放，降低血液GH濃度。同時SS還能調(diào)節(jié)GRF的釋放，影響GRF基因的表達，通過拮抗GRF的作用以協(xié)同控制GH的水平。（2）生長抑素在動物促生長領(lǐng)域的應(yīng)用：GH的水平影響骨、軟骨的生長以及肌蛋白的合成與沉積等，從而影響動物和人的生長狀況。在生產(chǎn)應(yīng)用上GH具有促生長，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等方面的作用，有著廣泛的經(jīng)濟價值和社會效益。生長抑素（SS）通過抑制垂體分泌GH，從而降低GH水平。目前在生產(chǎn)上采取降低SS水平，解除SS對GH、IGF－I等的抑制，達到促進動物生長的目的，如主動免疫技術(shù)。隨著胚胎技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在動物整體水平上敲除或沉默目的基因或?qū)胪庠椿蚋牧紕游锏纳a(chǎn)性能已得到了廣泛的研究與應(yīng)用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達水平可長久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉(zhuǎn)基因動物。（3）RNAi技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動物：RNAi（RNAinterference）稱為RNA干涉，通過雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)與之同源的mRNA降解，導(dǎo)致目標基因轉(zhuǎn)錄后緘默（posttranscriptionalgenesilencing,PTGS）的現(xiàn)象或機制。在動物機體中，有兩種小分子RNA能介導(dǎo)這種現(xiàn)象的發(fā)生，microRNA(miRNA)和siRNA。前者形成分子內(nèi)雙鏈RNA，后者形成分子間雙鏈RNA，兩者雙鏈RNA在細胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)Dicer酶切割成長度約為21~25個nt片段，即小分子雙鏈RNA。在解旋酶(helicase)的作用下解開雙鏈RNA，其中僅保留一條RNA鏈與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNAinducedsilencingplex,RISC)結(jié)合，根據(jù)堿基互補配對原則識別靶mRNA，引起靶mRNA被剪切降解或翻譯的抑制。2002年，Hasuwa等人成功地建立了第一例應(yīng)用RNAi的轉(zhuǎn)基因小鼠。幾乎同時多數(shù)研究者們利用RNA聚合酶III的啟動子構(gòu)建shRNA的載體應(yīng)用于轉(zhuǎn)染哺乳動物的細胞系，結(jié)果對靶基因均產(chǎn)生了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄后緘默效果，表達下降90%以上。2006年Dann等人通過慢病毒介導(dǎo)RNAi敲除了大鼠上的Dazal基因，構(gòu)建了兩條shRNA序列（pLLU2GDazl1和pLLU2GDazl2），結(jié)果這兩條轉(zhuǎn)基因序列對靶基因Dazal的表達均產(chǎn)生了幾乎完全的抑制，并在后代中獲得了穩(wěn)定的可遺傳的DazlshRNA轉(zhuǎn)基因大鼠。shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠的出現(xiàn)使得RNAi技術(shù)在哺乳動物整體水平上進行靶基因的敲低或緘默成為可能。研究表明與建立在胚胎干細胞和同源重組技術(shù)上的基因敲除相比，用RNAi技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因動物無論是時間上還是在效率上都有著很大的優(yōu)勢。（4）慢病毒載體的特點與構(gòu)建：慢病毒（lentivirus）是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，引起慢性感染得名。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比不僅感染分裂細胞、也感染非分裂細胞，即靜止細胞如神經(jīng)細胞、巨嗜細胞、造血干細胞和肌肉細胞等，大大提高了感染效率，感染之后能高效整合和表達目的基因。用慢病毒載體感染動物卵母細胞和胚胎細胞能有效構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物。Hofmann等用含GFP目的基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染豬胚胎，產(chǎn)下46只小豬中，有32只攜帶GFP基因，其中30只能表達GFP。同時用該載體轉(zhuǎn)染牛的卵母細胞時也獲得了GFP高表達率。慢病毒載體（lentiviralvector,LV）的構(gòu)建原理是將HIV1基因組中的順式作用元件（如包裝信號和長末端重復(fù)序列）和編碼反式作用蛋白的序列分離。載體系統(tǒng)分成包裝部分和載體部分，其中包裝部分由去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列構(gòu)成，僅提供病毒包裝所需蛋白；載體部分與包裝部分互補，含包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需順式作用序列。（5）慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用：慢病毒載體（LV）于1996年發(fā)展以來只是用于細胞轉(zhuǎn)染和基因治療的研究，但直到2002年Lois等將其用于轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠的制備，之后LV在制備轉(zhuǎn)基因動物上獲得極大的發(fā)展與應(yīng)用。與顯微注射法相比，免去了操作困難、效率低下和成本過高的缺點。LV法相對操作簡單、整合能力強，通過感染早期胚胎或受精卵細胞即可獲得轉(zhuǎn)基因胚胎。由于LV的高效率感染和在宿主細胞DNA上的高度整合特性，可以大大提高外源基因的轉(zhuǎn)移效率。其主要研究內(nèi)容為SSshRNA序列的復(fù)制缺陷型慢病毒載體（顆粒）的構(gòu)建與制備，其中包括了假型病毒（pseudotypedvirus）的包裝制備及病毒滴度的測定。2實驗材料2.1主要試劑2.1.1酶類：AMV、BamHⅠ、EcoRⅠ、ExTaqDNA聚合酶 、T4DNA連接酶均購自大連TaKaRa公司。2.1.2試劑盒：質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠片斷回收純化試劑盒均購自博大泰克公司。2.1.3其它試劑：DNAMarker、dNTPs、RibonucleaseInhibitor均購自大連TaKaRa公司；瓊脂糖購自O(shè)XOID公司；shRNAcopGFPLentivector從上海倍尼菲生物科技購得。DH5α、pcDNA3.1Vector由本室保存。溴化乙錠、氯仿、異丙醇、無水乙醇、瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、氨芐青霉素等試劑為進口或國產(chǎn)分裝試劑，均為分析純。2.2所用儀器FAI604S型電子精密天平 上海天平儀器廠DYC31B型瓊脂糖凝膠電泳槽 北京六一儀器廠DYY6B型電泳儀 北京六一儀器廠GeneAmpPCRSystem9600 PERKINELMER公司SHHW21Cr420型電熱恒溫水浴箱 北京市東霞電子儀器79HW1型恒溫磁力攪拌器 浙江樂成電器廠THZC型恒溫搖床 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠CR21F型低溫高速離心機 日本HITACHI公司臺式高速冷凍離心機 日本KUBOTA公司LD5-2A型普通離心機 北京醫(yī)用離心機廠DNA/RNA定量儀 瑞典PharmaciaBiotech公司超低溫冰箱 SANYO公司AXH型純水器 美國MILLIPORE公司其他為國產(chǎn)常規(guī)實驗室設(shè)備。2.3相關(guān)溶液配制1.LB培養(yǎng)基：2g胰蛋白胨，1g酵母提取物，2gNaCl，加蒸餾水至200mL，高壓滅菌，冷卻至40℃左右加入氨芐青霉素至終濃度為50μg/mL(AmpLB)，或加入卡那霉素至終濃度為50μg/mL(KanLB)2.LB平板：2g胰蛋白胨，1g酵母提取物，2gNaCl，瓊脂粉3g，加蒸餾水至200mL，高壓滅菌，冷卻至40℃左右加入氨芐青霉素至終濃度為50μg/mL(AmpLB)，或加入卡那霉素至終濃度為50μg/mL(KanLB)3.TE緩沖液：Tris20mmol/L，EDTA1mmol/L，調(diào)pH至8.0。4.50×TAE電泳緩沖液：Tris242g，冰醋酸57.1mL，EDTA37.2g,加蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH至8.5。5.0.7%~2%瓊脂糖凝膠溶液：瓊脂糖0.7g~2g，50×TAE電泳緩沖液2mL，加入EB至終濃度為0.5μg/mL，加蒸餾水至100mL。6.退火溶液：100mMKAc，2mMMgAc，30mMHEPES，KOH調(diào)pH至7.4。3實驗方法3.1生長抑素（SS）基因siRNA的設(shè)計3.1.1豬的SS基因mRNA序列的獲得豬的SS基因mRNA的序列從GenBank（http://./）上獲得（序列號：NM_001009583）。其總長度為351bp，全序列如下：ATGCTGTCCTGCCGCCTCCAGTGCGCGCTGGCCGCGCTCTCCATCGTCCTGGCTCTGGGCGGTGTCACTGGCGCGCCCTCGGATCCCCGACTCCGTCAGTTTCTGCAGAAGTCCCTGGCTGCTGCCGCTGGGAAGCAGGAACTGGCCAAGTACTTCTTGGCGGAGCTGCTCTCTGAACCCAACCAGACAGAGAACGATGCCCTGGAGCCTGAAGATTTGTCCCAGGCTGCTGAGCAGGATGAAATGAGGCTGGAGCTGCAGAGATCAGCTAACTCAAACCCGGCCATGGCACCCCGAGAACGCAAAGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGTTAG其編碼區(qū)為1~351bp，長度為351bp。3.1.2靶向SS的siRNA序列設(shè)計RNAi作用的成功與否，關(guān)鍵在于siRNA序列的結(jié)構(gòu)。不同的siRNA序列沉默基因的效率差別很大。因此，理性設(shè)計有效siRNA就成為實驗成功的一個關(guān)鍵因素。綜述前人的經(jīng)驗，以下為siRNA設(shè)計過程中較為重要的原則。1、從起始密碼AUG下游50～100nt開始，避開5’端或3’端的UTRs，搜索AA（N19）序列；2、有義鏈1位為G或C，19位為A或U，雙鏈5’端能量應(yīng)該比3’端高，即有義鏈15～19至少有3個A或U，或者13～19至少有5個A或U；3、siRNA5’端必須磷酸化，3’端懸垂兩個dTdT，或是UU；4、選擇GC含量在30%～50%的siRNA，亦有報道GC含量不宜超過36.8%；16位最好為C，13位最好為非G；5、避免超過三個G或三個C重疊，多聚G或多聚C序列能產(chǎn)生堆積形成類聚物而干擾沉默機制；6、使用BLAST(./BLAST/)將潛在的靶序列和相應(yīng)的豬的基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，排除那些和其它基因明顯同源的靶序列；7、由于RNApolⅢ啟動子的轉(zhuǎn)錄終止信號是連續(xù)的6個“T”的多聚核苷酸，因此，應(yīng)避免在靶序列中存在≥4個“T”或“A”的連續(xù)序列；8、對mRNA目標區(qū)域進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，排除那些作用于復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的siRNA序列。3.2SS及其siRNA靶序列二級結(jié)構(gòu)分析借用專業(yè)核酸序列二級結(jié)構(gòu)模擬網(wǎng)站（/cgibin/rnaform1.cgi）對351bpSSmRNA序列進行二級結(jié)構(gòu)模擬，檢索分析。選用極小自由能算法，使用RNAmfoldversion3.2server進行mRNA二級結(jié)構(gòu)模擬，相關(guān)參數(shù)按如下設(shè)置：折疊溫度37℃；離子狀態(tài)1mol/LNaCl，沒有二價離子；最優(yōu)與次優(yōu)結(jié)構(gòu)最大能量差異允許值為5%，模擬結(jié)構(gòu)最大數(shù)量為103.3發(fā)夾SSsiRNA轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸的設(shè)計與合成按照pshRNAcopGFPLentivector的說明進行設(shè)計與合成，圖11是如何將siRNA靶序列轉(zhuǎn)換成為轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸序列的程序示意圖。兩個反向互補排列的19nt特異性靶序列由一個12nt（5’CTTCCTGTCAGA-3’）的loop相連接，形成莖環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄模板兩端分別為BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，并以5個T作為RNApolⅢ的轉(zhuǎn)錄終止子。分別合成發(fā)夾siRNA轉(zhuǎn)錄模板的兩條相應(yīng)的DNA單鏈。由上海倍尼菲生物科技合成。圖11發(fā)夾siRNA轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計3.4SSsiRNA表達載體的構(gòu)建及鑒定圖12為pshRNAcopGFPLentivector載體圖，此載體帶有H1RNApolⅢ啟動子（3761bp～3977bp）及哺乳動物熒光篩選標記copGFP（2279bp～3037bp）。圖12pshRNAcopGFPLentivector載體圖1.退火，溶解轉(zhuǎn)錄模版DNA，稀釋至濃度為1μg/μL，準備退火溶液。單鏈各1μg混合于10×退火溶液中，90℃1~3min,37℃1h，得到轉(zhuǎn)錄模板雙鏈DNA插入片段，濃度為10ng/μL，2.載體酶切，體系如下：BamHⅠ 2μLEcoRⅠ 2μL10×K 4μLpshRNAcopGFP質(zhì)粒 20μLddH2O 12μL37℃，酶切過夜。1%3.連接，體系如下：退火產(chǎn)物 1μLT4DNALigaseBuffer 2μLpshRNAcopGFPLentivector 1μLT4DNALigase 0.5μL無核酶水 15μL充分混勻，16℃水浴連接，4.轉(zhuǎn)化。取連接反應(yīng)產(chǎn)物（設(shè)陰性對照質(zhì)粒）加入到適量E.coli(DH5α)感受態(tài)細胞中，具體步驟如下：取-80℃保存的DH5α感受態(tài)細胞，冰浴放置5～10將5μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞，用移液槍緩緩混勻，冰浴放置30分鐘；將混合物快速放入42℃恒溫電熱板上熱沖擊90秒，冰浴2將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入800μLLB培養(yǎng)基中，于搖床上37℃、200rpm培養(yǎng)45收集菌液，用50μL均勻涂不到LBAmp(50μg/mL)瓊脂平板上，晾干；倒置平皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～165.陽性菌落的PCR擴增。挑取樣品陽性單菌落，使用多克隆位點兩端的引物進行PCR擴增檢測陽性菌落。其中Fprimer：5’AATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’、Rprimer：5’LABuffer（MgCl2+）2.5μLTaq（2.5U/μL）0.25μLdNTP（25mM）4μLFprimer（10μM）0.25μLRprimer（10μM）0.25μLdH2O17.75μLPCR反應(yīng)條件如下：94℃94℃55℃72℃反應(yīng)進行33個循環(huán)，產(chǎn)物在4℃6.使用PCR產(chǎn)物5μL上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；7.若電泳片段大小正確，則挑取陽性菌落于3mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃8.提取質(zhì)粒，使用載體上的引物（F/Rprimer）將質(zhì)粒DNA送測序，比對測試結(jié)果與設(shè)計DNA的序列是否一致。4實驗結(jié)果4.1靶向SSmRNA的siRNA序列設(shè)計借助互聯(lián)網(wǎng)上IrisGenetics的軟件程序siRNADNADesigner1.3設(shè)計靶向SSmRNA（序列號：NM_001009583）的siRNA序列，依據(jù)Tuschl等關(guān)于siRNA的設(shè)計原則，將設(shè)計出的序列利用BLAST和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，排除那些和其它基因明顯同源的靶序列。最終選擇以下序列作為siRNA靶序列，記作S（GC含量為33.3%）。316bp:AAGAATTTCTTCTGGAAGACT4.2SS及其siRNA靶序列二級結(jié)構(gòu)分析351bpSSmRNA全序列中包括70個腺嘌呤(A)，109個胞嘧啶(C)，100個鳥嘌呤(G)，72個尿嘧啶(U/T)。按照網(wǎng)站要求的格式將351bpSSmRNA序列輸入窗口，二級結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果獲得一個最優(yōu)結(jié)構(gòu)和若干次優(yōu)結(jié)構(gòu)，最優(yōu)結(jié)構(gòu)dG=130.50kcal/mole，二級結(jié)構(gòu)見圖13。圖13SSmRNA二級結(jié)構(gòu)圖采用模擬的最優(yōu)結(jié)構(gòu)來分析siRNA的靶序列的局部折疊結(jié)構(gòu)，靶序列在SSmRNA中的位置為：316～336bp。siRNA的靶序列的局部二級結(jié)構(gòu)見圖14。圖14靶序列局部二級結(jié)構(gòu)圖綜合dGmin(1+5%)能級范圍內(nèi)的多能級預(yù)測結(jié)構(gòu)，形成局部單鏈區(qū)二級結(jié)構(gòu)圖譜，并結(jié)合最優(yōu)二級結(jié)構(gòu)靶位點處的局部結(jié)構(gòu)進行分析，siRNA所識別的靶序列均為單鏈區(qū)域較多的結(jié)構(gòu)，其中未成對堿基所占比例為10/21。4.3SSsiRNA轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸的設(shè)計及合成將siRNA設(shè)計成相應(yīng)的表達發(fā)夾shRNA的DNA單鏈模板，兩端分別為BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點，合成1對發(fā)夾shRNA轉(zhuǎn)錄模板的DNA單鏈，由上海倍尼菲生物科技合成，序列如下：5'GATCCGAATTTCTTCTGGAAGACTCTTCCTGTCAGAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTTTTG3'3'GCTTAAAGAAGACCTTCTGAGAAGGACAGTCTTCAGAAGGTCTTCTTTAAGAAAAACTTAA3'4.4SSsiRNA轉(zhuǎn)錄模板表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定pshRNAcopGFPLentivecto在BamHⅠ/EcoRⅠ體系下雙酶切回收，使其線性化；將轉(zhuǎn)錄模板DNA與線性化pshRNAcopGFPLentivector以T4DNALigase連接，從而構(gòu)建成表達針對SSsiRNA的重組表達載體shRNAcopGFPLentivectorSS，命名為：pS。重組表達載體經(jīng)轉(zhuǎn)化后在LBAmp平板上培養(yǎng)，再挑取陽性單菌落用以下一對引物進行PCR擴增，使用PCR產(chǎn)物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得圖15：通過空白（水作模板）對照，得知PCR反應(yīng)體系沒有受到污染，陽性結(jié)果可信。從電泳圖15中看出，重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化后，4道與5道的菌落鑒定與空載體大小相同，故可判斷質(zhì)粒沒有成功轉(zhuǎn)入DH5α；而6道中的條帶明顯比空白質(zhì)粒要大約61bp左右，可判斷質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入DH5α。將6道的陽性菌樣品質(zhì)粒送測序。結(jié)果證明插入序列均未發(fā)生突變，與原設(shè)計序列完全一致。下圖16和17為用熒光標記檢測RNAi的假型慢病毒轉(zhuǎn)染后在白光和熒光顯微鏡下的轉(zhuǎn)染率圖。圖16熒光標記檢測RNAi的假型慢病毒轉(zhuǎn)染后在白光下的轉(zhuǎn)染率圖17熒光標記檢測RNAi的假型慢病毒轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下的轉(zhuǎn)染率5討論siRNA是一種基于核酸的靶向抑制基因表達的分子，具有特異性和靶向性的特點。對于大多數(shù)基因來說，細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生的靶向mRNA的抑制作用足以下調(diào)目的基因的表達。siRNA能夠在低濃度的情況下實現(xiàn)基因沉默，效果比以有報道的反義寡核苷酸、核酶和脫氧核酶都好，因此，siRNA是最有效的反義分子。RNAi成功的關(guān)鍵是siRNA作用靶序列的設(shè)計選擇，即如何從SS的mRNA序列中找到siRNA的最佳靶位點是必須首先考慮的問題。我們利用網(wǎng)站檢索并排除了和其他基因明顯同源的靶序列。siRNA的干涉效率直接關(guān)系到基因治療的效果，目前關(guān)于siRNA干涉效率的研究主要集中在兩個方面：一方面研究siRNA的特點，強調(diào)siRNA雙鏈的熱力學結(jié)構(gòu)是高效沉默的先決條件；另一方面研究siRNA所識別的靶序列的特征，認為siRNA的抑制效果與其所識別靶序列的結(jié)構(gòu)有關(guān)。RNAi雖然具有很強的基因沉默能力，但識別同一靶mRNA的不同序列的siRNA的干擾效果卻不盡相同。得到高效的siRNA是利用RNAi基因功能和表達調(diào)控研究的基礎(chǔ)。有研究指出，在哺乳動物細胞中，siRNA的干涉效果除了受自身的結(jié)構(gòu)和功能特點影響外最終要的決定因素是其識別的靶mRNA的局部結(jié)構(gòu)特征。也就是說，盡管siRNA序列是實現(xiàn)RNA干涉的基礎(chǔ)，但其識別的靶序列局部復(fù)雜的結(jié)構(gòu)直接影響siRNA的干涉效率。因此我們將全長315bp的SSmRNA序列進行了二級結(jié)構(gòu)的模擬，結(jié)合局部二級結(jié)構(gòu)分析選擇位于mRNA莖環(huán)處的siRNA最佳靶位點。雖然我們所做了一個模擬結(jié)構(gòu)，但事實上mRNA在自然狀態(tài)下的折疊結(jié)構(gòu)是由短螺旋、凸泡、環(huán)等組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，還要考慮多方面影響。綜上所述，為了獲得有效的特異性的基因沉默，不僅要考慮siRNA本身的序列特點，好要考慮siRNA靶序列的結(jié)構(gòu)特點。因此，本次試驗僅僅設(shè)計出一條靶向siRNA序列是不足以說明問題的。事實上，在整個實驗過程中，通過多個靶位點的選擇，構(gòu)建并合成不同靶位點上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄模板，并通過檢驗其沉默效果，從而選擇最好的一個靶位點進行進一步的研究。因此，本實驗成功構(gòu)建插入發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄模板序列的重組質(zhì)粒，為日后進一步研究提供了備選依據(jù)。6結(jié)論1.在長度為351bp的豬的生長抑素（序列號：NM_001009583）mRNA序列中選擇并設(shè)計了1條siRNA。2.構(gòu)建表達發(fā)夾siRNA的質(zhì)粒載體shRNAcopGFPLentivectorSS（簡稱pS），經(jīng)測序與所設(shè)計的發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄模版序列完全一致。參考文獻：[1]王祎琴，張文露，張秉強．2007．靶向shRNA表達載體構(gòu)建方式的比較研究．生物技術(shù)通訊．01：105~106[2]白莉，楊忠亮，李榮田．2008．用于RNA干涉的siRNA的設(shè)計與合成．黑龍江科技信息．06：2[3]江青東．2007．生長抑素在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進展．上海畜牧獸醫(yī)通訊．03：10[4]李芬財．2005．生長抑素及其受體對脊椎動物生長發(fā)育的調(diào)控作用研究進展[J]．當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)．06：36~38[5]許德暉，黃辰，劉利英等．2006．高效siRNA設(shè)計的研究進展．28(11)：1457~1461[6]何晨，陳薇等．2005．干擾小RNA與微RNA[J]．生命的化學．25（5）：417~420[7]朱曉燕，岳保紅，張欽憲．20