油鏡使用與革蘭氏染色

教學目標

掌握油浸鏡的使用原理第一頁，共15頁。二．染色原理和油鏡的工作原理1．油鏡工作原理

油鏡的放大倍數最大（100），故鏡頭焦距短，直徑小,但所需光照強度卻最大。從標本片透過的光線是從玻片進入空氣，再進入鏡頭。由于玻璃和空氣的介質密度不同，有些光會因折射或反射而不能進入鏡頭。物象就顯現不清。為了不使通過的光線有所損失，須在油鏡與玻片之間加入折射率和玻璃

(n=1.52）相仿的香柏油

(n=1.515)。故而稱之為“油鏡”。第二頁，共15頁。轉換器:其上裝置各種不同放大倍數的物鏡，用以轉換物鏡至使用位置上。第三頁，共15頁。聚光鏡:

位于載物臺的下方，可以上下移動，以使光線集中于檢查的標本上光圈:

位于聚光鏡之下，可以放大和縮?。挥靡哉{節進入聚光鏡的光量。第四頁，共15頁。四、顯微鏡的使用1、取顯微鏡：右手握鏡臂，左手托住鏡座。2、打開電源（調節反光鏡）使射入鏡頭光線最強。3、上提集光器。4、打開光圈。5、將標本片放在載物臺上，用片夾固定。第五頁，共15頁。

6、調節轉換器，先使低倍鏡對準中央，尋找適宜的視野。7、于標本片的欲檢部位滴加香柏油。8、然后轉換油鏡鏡頭，使其對準中央。9、兩眼對準目鏡，向上轉動粗調節器，直至見到模糊物像為止。10、轉動細調節器，直至物像完全清晰為止。

第六頁，共15頁。（１）將載物臺降至最低，取下標本片。（２）將光量調至最小，關上電源。（３）擦試鏡頭：先用干擦鏡紙擦掉香柏油；再用滴加少量乙醚的擦鏡紙擦試；最后再用干擦鏡紙擦拭。

（4）低倍鏡對準中央（5）將顯微鏡放入鏡箱，還原。顯微鏡的維護第七頁，共15頁。

革蘭氏染色法：革蘭氏染色法將細菌分為G＋和G-

，這由兩類細菌細胞壁的結構和組成的不同而決定。用結晶紫初染后，所有的細菌都染上藍紫色。碘作為媒染劑能與結晶紫結合形成結晶紫-碘的復合物，增強了染料與菌體的結合力。用乙醇脫色處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。G＋細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成，且壁厚、類脂含量低，用乙醇脫色時使細胞壁脫水、網狀結構孔徑縮小，通透性降低，使得結晶紫—碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內。雖經洗脫和復染仍然保持初染劑的藍紫色。G-細菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄，脂含量高，所以在脫色處理時，類脂被乙醇溶解，細胞壁的通透性增大，使結晶紫—碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的顏色。第八頁，共15頁。實驗器材

1．顯微鏡、香柏油、接種環、酒精燈等。

2．結晶紫染液（I）、碘液（II）、95%乙醇（III）、稀釋的石碳酸復紅染液（IV）。

3．菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。第九頁，共15頁。方法與步驟：涂片干燥固定染色洗滌干燥鏡檢第十頁，共15頁。實驗步驟

1．涂片取一塊載玻片，用記號筆劃分出兩區域并做上記號，在兩區域中央各滴半滴生理鹽水，用接種環以無菌操作法分別取兩種菌種在左右兩滴鹽水中，和勻后涂成薄膜。

2．干燥室溫自然干燥或吹干。

3．固定涂面朝上，通過火焰2~3次。

4．染色在涂片薄膜上滴加結晶紫染液，使之覆蓋2分鐘。

5．水洗傾倒去染液，斜置載玻片，用洗瓶小水流沿玻片邊緣沖洗，直至水呈無色為止。

第十一頁，共15頁。

6.媒染加媒染劑碘液使之覆蓋1分鐘，水洗。

7.脫色滴加95%乙醇數滴，立即水洗,。

8.復染復紅液復染30s-1分鐘，水洗，吸干。

第十二頁，共15頁。注意事項：（1）涂片不宜過厚，否則難以干燥。（2）涂片時滴加無菌水不宜多，否則難以干燥。（3）固定時，通過火焰速度宜適度，過快達不到固定目的，過慢易使菌體變形，絕不能在火焰上烤，招致原形毀壞。（4）標本必須干燥，才能置于油鏡下觀察。第十三頁，共15頁。

實驗結果

觀察兩種細菌的形態和顏色，繪出油鏡下細菌形態圖，說明革蘭氏染色的結果。

思考題

1.通過實驗，你認為革蘭氏染色成功關鍵是那一步？為了避免假陽性或假陰性出現，在對未知菌種做革蘭氏染色鑒定時，你認為應該怎樣做？

2.使用油浸鏡時為什么要用香柏油？