基因敲除與高表達、細胞培養技術

1、基因高表達利用高表達質粒載體pCaEXP通過基因同源重組方法構建SODs基因高 表達的VX2瘤株肝癌模型。一、材料、試劑和儀器高表達質粒載體pCaEXP，大腸桿菌，培養基（按配方配制酵母浸膏 蛋白月東葡萄糖培養基），限制性內切酶；Pyrobest DNA olymerase、 DNA Marker DL2000、Goldview核酸染料，質粒DNA小量抽提試劑 盒、PCR產物純化試劑盒，瓊脂糖，小量酵母菌總R NA抽提試劑盒， Real Time RT-PCR 所用試劑；Real Time PCR儀，FR-200紫外與可見分析裝置，電泳槽，高 速冷凍離心機，恒溫振蕩培養箱。二、方法步驟為了實現

2、SODs基因的高表達，將SODs基因完整開放閱讀框（ORF） 連接于高表達質粒載體pCaEXP中MET3啟動子的后面，以實現MET3 對SODs基因ORF的控制。1、首先用基因組抽提試劑盒抽提SODs基因組，在SODs基因組中用含 有Bam H I和Pst I酶切位點的引物P1和P2擴增SODs基因ORF全長。2、使用上述兩個酶分別酶切SODs基因的ORF和pCaEXP質粒，酶切 產物純化后使用T4 DNA ligase進行連接。將連接產物轉化感受態 大腸桿菌DH5a，在含氨芐青霉素的LB固體培養基上進行篩選，挑取 陽性克隆擴增后采用質粒抽提試劑盒小量抽提質粒，然后對所抽提 的高表達質粒載體p

3、CaEXP-SPE 1采用酶切方法進行鑒定。基因敲除基因敲除兔肝癌模型制備，方法有很多種，如傳統ES打靶、 TALEN、CRISPR/Cas9，還有 TetraOneTM 基因敲除。以 CRISPR/Cas9 技術為例：一、材料、試劑和儀器sgRNA; UCA試劑盒（對sgRNA/Cas9進行活性檢測），質粒載體， sgRNA/Cas9 mRNA，PCR試劑盒，其他常規試劑；全自動生化分析儀，微量移液器，電熱恒溫水浴箱，超凈工作臺， 凝膠圖像掃描儀，微波爐，混勻器，離心機，生物顯微鏡。二、方法步驟EGE技術（基于Crispr cas9技術）設計構建識別靶序列的sgRNA;設計構建致靶基因切割的

4、EGE系統載體質粒；利用UCA試劑盒對sgRNA/Cas9進行活性檢測；設計構建打靶載體；體外轉錄 sgRNA/Cas9 mRNA;兔肝癌原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶載體；獲得Fo代兔，利用PCR對Fo代兔進行基因型鑒定；獲得F1代兔，利用PCR和southern blot雜交技術對F1代兔進 行基因型鑒定。細胞培養一、材料、試劑和儀器 主要儀器與試劑勻膠機，光刻機，體視顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，等離子鍵合機， 酶標儀，圖像處理軟件，CO培養箱，水浴鍋，灌流泵，大容量離心 機，超凈工作臺，移液器等；海藻酸鈉，氯化鈣，檸檬酸鈉，熒光素鈉，胰蛋白酶，小牛血清， RPMI-1640培養

5、基，胰蛋白酶，L-谷氨酰胺SU-8光刻膠及顯影液， Sylgard184型聚二甲基硅氧烷，染色劑，以及青霉素與鏈霉素。二、方法步驟HBSS 溶液：取 HBSS 47. 5 m L,分別加入 0. 5 mol / L EGTA0. 05 m L和1 mol / L HEPES2. 5 m L,充分均勻,4C保存備用。SFM培養液：取RPMI-1640培養基45 m L,分別加入50以g / m L 青鏈霉素0. 5 m L,10 mg /m L鏈霉素0. 25 m L,滅活小牛血清5 m L,200 mmol/L L-谷氨酰胺0. 5 m L,充分混勻備用。將細胞接種于培養皿中37C,5% CO2培養箱