10-感染性疾病的診斷PPT精選文檔

1、1第三篇 分子診斷以分子診斷以DNA、RNA和蛋白質為材料，和蛋白質為材料，通過應用分子生物學技術，檢查基因的存通過應用分子生物學技術，檢查基因的存在、結構缺陷或表達異常，從而對人體狀在、結構缺陷或表達異常，從而對人體狀態和疾病作出診斷。態和疾病作出診斷。 著重介紹感染性疾病、遺傳性疾病、復雜著重介紹感染性疾病、遺傳性疾病、復雜疾病等的分子診斷基本策略和方法。疾病等的分子診斷基本策略和方法。2 分子診斷的臨床意義在于不僅能夠對疾分子診斷的臨床意義在于不僅能夠對疾病作出早期診斷、確切診斷，而且還能確病作出早期診斷、確切診斷，而且還能確定個體歸于疾病的易感性以及疾病的分期定個體歸于疾病的易感性以及

2、疾病的分期分型、療效監測、預后判斷等。隨著分子分型、療效監測、預后判斷等。隨著分子診斷學的發展，分子診斷的原理和方法不診斷學的發展，分子診斷的原理和方法不僅適用于遺傳性疾病，而且也廣泛應用于僅適用于遺傳性疾病，而且也廣泛應用于感染性疾病、腫瘤等醫學領域。感染性疾病、腫瘤等醫學領域。 從生物中心法則來看，分子診斷包括檢從生物中心法則來看，分子診斷包括檢測基因的結構異常和基因表達異常。常見測基因的結構異常和基因表達異常。常見的分子診斷方法如下：的分子診斷方法如下： 3DNAmRNA蛋白質蛋白質轉轉 錄錄反轉錄反轉錄 翻翻 譯譯 PCR DNA測序測序Southern-blot基因芯片基因芯片基因結

3、構異常基因結構異?；虮磉_異?；虮磉_異常RT-PCR FQ-PCR Nothern-blot 基因芯片基因芯片ELISAWestern-blot 組織化學染色組織化學染色蛋白質芯片蛋白質芯片中心法則中心法則檢測方法檢測方法45第十四章第十四章感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷生物化學與分子生物學學科生物化學與分子生物學學科2011.46第一節第一節 概概 述述感染性疾病感染性疾病：由某種病原體所致，通過不：由某種病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并出現臨床癥同方式引起人體發生感染并出現臨床癥狀的疾病。狀的疾病。 病原體病原體：病毒、細菌、原蟲、支原體、：病毒、細菌、原蟲、支原體、

4、 衣原體、立克次體。衣原體、立克次體。 7常規檢測方法：常規檢測方法： 免疫學方法免疫學方法 微生物學方法微生物學方法 受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。信息。8分子生物學方法：分子生物學方法： 聚合酶鏈式反應（聚合酶鏈式反應（PCR） 核酸雜交核酸雜交 基因芯片基因芯片 早期、特異地進行診斷，能提供病原體早期、特異地進行診斷，能提供病原體分型及耐藥性方面的信息，同時進行大量基分型及耐藥性方面的信息，同時進行大量基因的檢測。因的檢測。9一、一、感染性疾病的分子診斷，其診斷感染性疾

5、病的分子診斷，其診斷策略可以分為以下兩種：策略可以分為以下兩種：一般性檢出策略一般性檢出策略，即只需要提供是否有，即只需要提供是否有某種病原體的感染；某種病原體的感染；完整檢出策略完整檢出策略，即不僅對病原體做出診，即不僅對病原體做出診斷，還要進行分型（包括亞型）和耐斷，還要進行分型（包括亞型）和耐藥性方面的檢測。藥性方面的檢測。 101. 一般性檢出策略和方法一般性檢出策略和方法 針對針對特異性的核酸序列特異性的核酸序列進行核酸分子探進行核酸分子探針雜交，或者利用針雜交，或者利用常規常規PCR技術直接檢技術直接檢出微生物的出微生物的DNA/RNA，它能夠判斷，它能夠判斷有有無感染無感染和是和

6、是何種病原體感染何種病原體感染。112. 完整檢出策略和方法完整檢出策略和方法 按照診斷按照診斷分型分型亞型亞型耐藥性檢耐藥性檢測的思路測的思路，利用多種分子診斷手段對感，利用多種分子診斷手段對感染性病原體進行分析。染性病原體進行分析。 基因芯片基因芯片、基因測序基因測序等等 12二、感染性疾病分子診斷的常用方法 根據目的基因是否被放大， 可分為雜交法和擴增法。 信號放大技術檢測方法 靶分子數目不變，而檢測的探針信號放大 采用多酶、多探針或二者結合等方法來增加探針標志物的濃度使檢測信號得到放大。 靶分子擴增技術檢測方法 靶分子（RNA、DNA或探針）的擴增 PCR、替代擴增、LCR等13分支鏈

7、DNA信號放大技術(bDNA)14nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)15Figure 1. Target generation scheme for SDA. This figure depicts the initial stepsin an SDA reaction which transform the original target sequence into theamplification cycle depicted in Figure 2.Figure 2. The SDA reaction cycle. Thes

8、e reaction steps continuously cycle during the course of amplification.16NoImage引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 355535353cDNA cDNA模板 553353引物B RNAseH RT T7RNA聚合酶 100-1000 RNA擴增子 53533535引物A 355RNAseH RNA RNA cDNA cDNA 5端帶有T7RNA聚合酶結合位點，3端堿基與靶RNA 3端序列互補;的堿基序列與cDNA 3端序列互補17三、感染性疾病分子診斷的標本處理 標本采集處理主要包括選擇合適的標本種類、

9、標本量、抗凝劑等及對標本進行合適的傳送、保存和預處理。18四、感染性疾病分子診斷的結果解釋1. 陰性結果 假陰性可能性 方法的靈敏度太低 方法失敗 目標分子2. 陽性結果 假陽性可能性 方法的特異性 受到污染193. 定性檢測結果 有時不能提供病原體活力相關信息 臨床治療病情緩解后一定時間內，在患者樣本中仍可以檢測出相應的病原體。 有些病原體潛伏在進體內，沒有臨床癥狀。4. 疾病狀況的判斷 檢測出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。 該病原體可能是一種正常菌群 20五、感染性疾病分子診斷的臨床應用及評價 用于感染性疾病治療的監控和預測、病情發展過程的危險性評價及疾病預后等。 耐

10、用性的檢測 細菌的分型 流行病調查21第二節第二節 病毒的基因檢測病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾病的病的75%75%左右。左右。400400多種不同病毒。多種不同病毒。病毒結構：大病毒結構：大 小：小：20-300nm 20-300nm 核心區：核酸（核心區：核酸（DNADNA或或RNARNA） 外周衣殼：蛋白質外周衣殼：蛋白質 包膜：脂質（鑲嵌有蛋白質）包膜：脂質（鑲嵌有蛋白質）22 我國是我國是HBVHBV高流行區，高流行區，50%50%70%70%的人受

11、的人受過感染，過感染，8%8%10%10%是是HBVHBV攜帶者，肝炎患者攜帶者，肝炎患者中中60%60%是慢性肝炎患者，導致肝硬變，是慢性肝炎患者，導致肝硬變，HBVHBV又與原發性肝癌密切相關。又與原發性肝癌密切相關。 外殼（外殼（HBsAg): HBsAg): 外殼蛋白成分為表面抗原外殼蛋白成分為表面抗原 核心（核心（HBcAg)HBcAg)： DNA DNA DNA DNA 聚合酶聚合酶 HBcAgHBcAg一、一、 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒23Dane顆粒（完整的病毒）形態顆粒（完整的病毒）形態HBsAgHBcAgHBV DNADNAPol（外膜蛋白）（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）（核衣

12、殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米由雙層外殼和一個核心組成的，核心直徑為27納米， 內含DNA雙鏈和DNA多聚酶24（一）病毒基因組結構（一）病毒基因組結構 3.2kb3.2kb雙鏈雙鏈DNADNA病毒病毒 不完全雙連環狀不完全雙連環狀DNADNA 長鏈長鏈L L為負鏈：有為負鏈：有4 4個開放閱讀框個開放閱讀框S S、C C、P P、X X S S區編碼外膜蛋白（區編碼外膜蛋白（HBsAgHBsAg） C C區編碼區編碼HBeAgHBeAg 、HBcAgHBcAg p p區編碼區編碼DNADNA聚合酶聚合酶 X X區位編碼區位編碼X X蛋白，可能與病毒蛋白表蛋白，可能與病毒蛋白表 達有關

13、。達有關。 短鏈短鏈S S為正鏈：長短不一為正鏈：長短不一25pre-s1 pre-s2S P P C C pre-c XHBV DNA 3.2 kbpre-S1 pre-S1蛋白蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAgHBVHBV基因組結構基因組結構26272829（二）分子診斷（二）分子診斷 常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期，不易早期診斷。在窗口期，不易早期診斷。 1.PCR 1.PCR 采用普通采用普通PCRPCR、FQ-PCRFQ-PCR、競爭性、競

14、爭性PCRPCR、免疫、免疫雜交雜交PCRPCR，可提供直接、準確的病原學診斷證，可提供直接、準確的病原學診斷證據。引物是根據據。引物是根據S S、C C、P P、X X基因中高度保守基因中高度保守序列設計，決定擴增的特異性和敏感度。序列設計，決定擴增的特異性和敏感度。30擴增位置擴增位置 引物序列引物序列 擴增片斷（擴增片斷（bp) bp) P P、X X基因基因 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 C C基因基因 5-A

15、TACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 C C基因基因 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3

16、 31 有時為了證實擴增產物的特異性，對擴增產有時為了證實擴增產物的特異性，對擴增產物進行以下分析：物進行以下分析： RLFP 斑點雜交斑點雜交 Southern雜交雜交 322. 2. 支鏈支鏈DNADNA信號放大技術信號放大技術(bDNA(bDNA） 原理原理: : 捕獲探針捕獲探針 檢測檢測 靶探針靶探針1 1 體系體系 靶探針靶探針2 2 bDNA bDNA分子分子:DNA:DNA主鏈上結主鏈上結 合多個側鏈合多個側鏈 33 捕獲探針固化在微孔板上捕獲探針固化在微孔板上 靶探針靶探針1 1分別與捕獲探針及待測核酸雜交分別與捕獲探針及待測核酸雜交 靶探針靶探針2 2分別與待測核酸及分別與

17、待測核酸及bDNAbDNA雜交雜交 形成復合物：形成復合物：固相支固相支持物持物捕獲捕獲探針探針靶探靶探針針1CEs待測待測核酸核酸靶探靶探針針2LEsbDNA復合物復合物34分支鏈DNA信號放大技術(bDNA)35 信號檢測：信號檢測：bDNA可結合很多酶標探針，酶可結合很多酶標探針，酶催化底物（催化底物（1,2-二惡二酮，二惡二酮，dioxetane）發光，）發光，使核酸信號放大，且發光強度與使核酸信號放大，且發光強度與DNA量成正量成正比。比。 優點：放大倍數確定優點：放大倍數確定 陽性檢出率高陽性檢出率高 穩定性和可重復性好穩定性和可重復性好 操作簡便，省時，易于普及操作簡便，省時，易

18、于普及36支鏈支鏈DNA技術技術373.基因芯片技術基因芯片技術 標本經標本經PCR擴增后與芯片上的特異探擴增后與芯片上的特異探針進行雜交，可以檢測：針進行雜交，可以檢測： 是否有病毒感染是否有病毒感染 感染病毒的種類及亞型感染病毒的種類及亞型 病毒的耐藥情況病毒的耐藥情況 特點：可同時進行大量標本的檢測特點：可同時進行大量標本的檢測38近年來陸續上市的核苷(酸)類似物對HBV的治療壓力集中在P區。干擾素治療對HBV的壓力主要集中在前C/C區及前S區。lamivudineadefovirentecavirtelbivudine394041（三）臨床意義（三）臨床意義1.1.早期診斷早期診斷 免

19、疫學檢測敏感性：免疫學檢測敏感性： 0.10.1g/ml g/ml 核酸雜交檢測敏感性：核酸雜交檢測敏感性：0.1pg/ml 0.1pg/ml PCR PCR檢測：檢測： 0.1fg/ml 0.1fg/ml 因此，在感染早期即可通過因此，在感染早期即可通過DNADNA檢測證實檢測證實病毒的存在。病毒的存在。422.監測治療效果監測治療效果: HBVDNA107拷貝拷貝/ml提示病毒復制活躍；提示病毒復制活躍； HBVDNA104拷貝拷貝/ml治療有一定療效；治療有一定療效； HBVDNA103拷貝拷貝/ml、HBeAg陰轉、轉陰轉、轉氨酶正常為乙型肝炎臨床治愈指標；氨酶正常為乙型肝炎臨床治愈指

20、標；3.判斷病情，指導制定合理的治療方案判斷病情，指導制定合理的治療方案434.病毒耐藥性的檢測病毒耐藥性的檢測 乙肝病毒乙肝病毒DNA聚合酶聚合酶YMDD處的突變是病處的突變是病毒產生耐藥性的重要原因，通過監測毒產生耐藥性的重要原因，通過監測YMDD的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信息，指導抗病毒治療。息，指導抗病毒治療。44二、流行性感冒病毒二、流行性感冒病毒 流行性感冒病毒流行性感冒病毒(Influenza virus)，是引起，是引起流行性感冒的病原體流行性感冒的病原體; 分為甲分為甲(A)、乙、乙(B)和丙和丙(C)3個個型別型別; 根據病毒

21、顆粒表面根據病毒顆粒表面(Haemagglutinin ，HA)和和(Neuramiridase，NA)的抗的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型亞型。 甲型流感病毒易發生變異，致病力強，甲型流感病毒易發生變異，致病力強，1918年發生在西方國家的大流感殺死了幾千萬人，年發生在西方國家的大流感殺死了幾千萬人， 即是由甲型流感病毒引起。即是由甲型流感病毒引起。 There are 16 different H antigens (H1 to H16) and nine different N antigens (N1 to N9).4546（一）流感病毒基因組結

22、構（一）流感病毒基因組結構 單鏈單鏈RNA病毒，病毒，RNA為負鏈；為負鏈； 有有8個個RNA片段或片段或7個個RNA片段；片段； 所有所有RNA片段片段5末端和末端和3末端高度保守；末端高度保守； 兩種不同亞型病毒感染宿主時，會生成基因兩種不同亞型病毒感染宿主時，會生成基因重配的新病毒；重配的新病毒； RNA基因在復制過程中基因在復制過程中 常會發生點突變。常會發生點突變。 47（二）分子診斷方法（二）分子診斷方法 可采用可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測流感病毒檢測流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非結構基因。引物常按流感病毒保守的非結構基因（NS）的序列進行設計。）的序列進行設計。

23、 為證實為證實PCR擴增產物的特異性或提高檢測的擴增產物的特異性或提高檢測的靈敏度，可用限制性內切酶分析法、斑點雜靈敏度，可用限制性內切酶分析法、斑點雜交法、交法、Southern印跡法進行擴增產物的分析。印跡法進行擴增產物的分析。 48擴增位置擴增位置 引物序列引物序列 擴增片段大小擴增片段大小 NS基因基因 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190 (bp) 5-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3 NS基因基因 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241 (bp) 5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3 49（三）臨床意義（三）臨床意義 流

24、感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。時，靈敏度低，難以作出早期診斷。 PCR法敏感、特異、簡便、快速，并且可法敏感、特異、簡便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學調查。用于流感病毒的分型和流行病學調查。 50 HIV，human immunodeficiency virus AIDS，acquired immunodeficiency syndrome HIVHIV為艾滋病的病原體?，F已發現引起艾滋病為艾滋病的病原體。現已發現引起艾滋病的病毒有的病

25、毒有HIV-1HIV-1、HIV-2HIV-2、HIV-3HIV-3三種。三種。 19981998年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數為年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數為3.3403.340萬，已死亡萬，已死亡1.3901.390萬，是全球十大主要萬，是全球十大主要死因之一。死因之一。51 最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；其內為核衣殼。細胞所必不可少的；其內為核衣殼。52532.基因組結構基因組結構 逆轉錄病毒，兩個拷貝的單股正鏈逆轉錄病毒，兩個拷貝的單股正鏈RNA； 每個每個RNA長約長約9.7Kb，有，有5帽，帽，3端有

26、多聚端有多聚尾；尾； HIV是一種高度變異的病毒；是一種高度變異的病毒； 含有含有gag、env 和和 pol三個基因以及三個基因以及6種調控種調控基因基因 tat, vif, vpr, vpx, nef, rev。 54gag基因編碼病毒的核心蛋白；基因編碼病毒的核心蛋白； pol基因編碼病毒復制所需要的酶類（逆轉基因編碼病毒復制所需要的酶類（逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶）；錄酶、整合酶和蛋白酶）； env基因所編碼病毒包膜蛋白，是基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學免疫學診斷的主要檢測抗原。診斷的主要檢測抗原。 調控基因編碼輔助蛋白，調節病毒蛋白合成調控基因編碼輔助蛋白，調節病毒蛋白合成和復

27、制。和復制。 555657（二）分子診斷方法（二）分子診斷方法抗體的檢測：酶聯免疫吸附法（抗體的檢測：酶聯免疫吸附法（ELISAELISA）和免）和免疫熒光檢測法（疫熒光檢測法（IFAIFA）；感染）；感染2 2周后才能逐漸周后才能逐漸產生病毒抗體；產生病毒抗體； 抗原的檢測：酶聯免疫吸附法（抗原的檢測：酶聯免疫吸附法（ELISAELISA）檢測）檢測P24P24抗原，靈敏度低抗原，靈敏度低581.病毒載量檢測病毒載量檢測 感染者體內感染者體內HIV的定量檢測，對病情判斷和的定量檢測，對病情判斷和治療效果檢測極有價值。治療效果檢測極有價值。 目前常用三種技術：目前常用三種技術： RT-PCR

28、最低檢測限最低檢測限50拷貝拷貝/ml bDNA 最低價測限最低價測限50拷貝拷貝/ml NASBA 最低檢測限最低檢測限20拷貝拷貝/ml59PCR RNA逆轉錄逆轉錄cDNA整合到宿主基因組中復整合到宿主基因組中復制，以被感染細胞制，以被感染細胞DNA為模板為模板PCR擴增；擴增； HIV為高變異病毒，不同患者體內分離的病為高變異病毒，不同患者體內分離的病毒基因結構有差異，引物設計應根據各編碼毒基因結構有差異，引物設計應根據各編碼區的保守序列設計；區的保守序列設計； 靈敏度高，特別是用于無癥狀靈敏度高，特別是用于無癥狀HIV感染者。感染者。 60擴增位置擴增位置 引物序列引物序列 擴增片斷

29、（擴增片斷（bp) bp) gaggag基因基因 5-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3 5-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3 342 342 5-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3 5-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3 gapgap基因基因5-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3 5-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3 115 115 5-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3 5-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3 polpo

30、l基因基因5-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3 5-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3 360 360 5-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3 5-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3 61 核酸序列依賴的擴增核酸序列依賴的擴增 NASBANASBA Nucleic acidNucleic acidsequence-basedsequence-basedamplificationamplification NASBANASBA原理原理: : 將引物、標本加入擴增反應液，將引物、標本加入擴增反應液，6565使使RNARNA分子二級結

31、構打開分子二級結構打開, ,降溫至降溫至3737加入逆加入逆轉錄酶轉錄酶,T7RNA,T7RNA聚合酶和聚合酶和RNaseRNaseH,H,并在并在3737反應反應1 11.51.5小時小時, ,其產物經瓊脂糖電泳，溴乙錠染色其產物經瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶。其主要產物為單鏈即可在紫外儀下看到條帶。其主要產物為單鏈RNA, RNA, 用于用于RNARNA的擴增、檢測及測序。的擴增、檢測及測序。6263 NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個反應過程由三種不需溫度循環。整個反應過程由三種 酶控制，酶控制，循環次數少，忠實性

32、高循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于其擴增效率高于PCR，特異性好。特異性好。 642.病毒表型和耐藥檢測 HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測 最常用的耐藥檢測方法是基因型檢測方法, 即查找與病毒耐藥有關的基因突變。檢測病毒逆轉錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結果與已知的沒有發生突變的HIV（稱為野生株）基因序列進行比較，與之不同的基因序列就認為發生了突變。檢測出的任何突變都有可能導致形成HIV耐藥性，但具體結果的解釋必須要有非常有經驗的專家和醫師來進行。 65（三）臨床意義（三）臨床意義1.1.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位；原位雜交：可以顯示病毒感染的部

33、位； 2.PCR2.PCR：可對無癥狀的感染者進行早期診斷；：可對無癥狀的感染者進行早期診斷； 3.3.病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定及療病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定及療效觀察上極有價值。效觀察上極有價值。 66第三節：病原菌的基因檢測第三節：病原菌的基因檢測 概述概述 正常菌群：存在于人體表及與外界相通部正常菌群：存在于人體表及與外界相通部位的細菌；位的細菌； 條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；引起疾病的一類細菌； 病原菌：具有毒性和侵襲力的細菌，造成病原菌：具有毒性和侵襲力的細菌，造成人體感染；人體感染；67 病原菌的診斷

34、方法：病原菌的診斷方法： 直接涂片法直接涂片法 生化試驗生化試驗 血清學試驗血清學試驗 分離培養分離培養 動物實驗動物實驗 分子生物學：靈敏、特異，可進行早分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；期診斷、分型、耐藥性檢測；不能確診或進行不能確診或進行分型、耐藥性的分型、耐藥性的檢測，或費時等檢測，或費時等68 全世界全世界1/51/5人口感染，每年約人口感染，每年約300300萬死于萬死于結核，中國占結核，中國占70%70%，免疫低下個體特別是，免疫低下個體特別是HIVHIV感染者更易于感染結核分枝桿菌。感染者更易于感染結核分枝桿菌。 結核分枝桿菌為革蘭氏陽性菌，結核分枝桿菌

35、為革蘭氏陽性菌，細長略細長略帶彎曲，帶彎曲，分枝狀，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性，有莢膜，抗酸染色陽性，對多種抗生素有抵抗力。對多種抗生素有抵抗力。一一. 結核分枝桿菌結核分枝桿菌69形形 態態 70(一一)基因組結構基因組結構 1.TB H37Rv株基因組是環狀雙鏈株基因組是環狀雙鏈DNA， 共有共有4 411 529bp; 2.共有共有4033基因，功能已知的有基因，功能已知的有1734個個, 1694個可能為新基因個可能為新基因; 3.基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列，基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶。包括水解酶或者藥物修飾酶。 717273（二）分子診

36、斷方法（二）分子診斷方法 普通普通PCR、FQ-PCR、競爭性、競爭性PCR、免疫雜交、免疫雜交PCR 擴增靶序列：擴增靶序列： 65KDa抗原基因（細菌細胞壁上蛋白）抗原基因（細菌細胞壁上蛋白） MPB蛋白基因（結核桿菌復合群特有）蛋白基因（結核桿菌復合群特有） rRNA基因基因 （種屬鑒定）（種屬鑒定） ISDNA6110插入序列插入序列74靶序列靶序列 引物序列引物序列 擴增片斷（擴增片斷（bpbp） IS6110IS6110插入插入 5-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3 5-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3 317 317 5-TCAGCCGCGTCCACGCC

37、GCCA-3 5-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3 16SrRNA 5-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3 16SrRNA 5-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3 463 463 5-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3 5-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3 DNADNA重復序列重復序列 5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3 5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3 245 245 5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3 5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3 75TB耐藥檢測 利福平耐藥-RNA聚合

38、酶rpoB基因 異煙肼耐藥-katG基因 鏈霉素耐藥-S12的rpsL基因 16SrRNA的rrs基因 喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因 水解酶或藥物修飾酶（-內酰胺酶、氨基糖苷乙酰基轉移酶和藥物外排系統等）76細菌耐藥基因的檢測細菌耐藥基因的檢測 細菌耐藥性的產生導致治療失敗、感染復發、細菌耐藥性的產生導致治療失敗、感染復發、增加昂貴抗生素的使用。增加昂貴抗生素的使用。 機理：由于細菌基因組的變異，導致機理：由于細菌基因組的變異，導致 1.1.細菌細胞外膜通透性改變；細菌細胞外膜通透性改變； 2.2.產生滅活酶和鈍化酶，如產生滅活酶和鈍化酶，如 - -內酰胺酶；內酰胺酶；

39、3.3.藥物作用靶位改變；藥物作用靶位改變； 4.4.代謝途徑改變；代謝途徑改變；77（三）臨床意義（三）臨床意義1.1.準確、快速、早期診斷準確、快速、早期診斷TB TB 2.2.區分區分TBTB與其它分枝桿菌與其它分枝桿菌 3.3.疫情監控和抗癆治療療效的評價疫情監控和抗癆治療療效的評價 78二、二、 淋球菌淋球菌 淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我國性傳播疾病種中，唯一自然宿主。淋病在我國性傳播疾病種中，發病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現和流發病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現和流行對淋病的控制帶來很大困難。行對淋病的控制帶來很大困難

40、。 傳播途徑：傳播途徑：1.1.直接性接觸感染直接性接觸感染 2.2.間接接觸感染間接接觸感染 7980（一）基因組結構（一）基因組結構 1.染色體分子量染色體分子量980M，可編碼約，可編碼約5000個基個基因，因，GC含量為含量為50%； 2.無操縱子結構無操縱子結構 3. 含有含有1至數個至數個質粒質粒（2.6MDa，24.5MDa），），通過質粒介導耐藥性在不同菌株間的轉移；通過質粒介導耐藥性在不同菌株間的轉移； 8182（二）分子診斷（二）分子診斷 1.PCR: 1.PCR: 擴增的靶序列：編碼外膜蛋白擴增的靶序列：編碼外膜蛋白的結構基的結構基因，或因，或16SrRNA16SrRNA

41、基因、基因、CPPBCPPB基因（同時存在于基因（同時存在于染色體及質粒上）染色體及質粒上） 83靶序列靶序列 引物序列引物序列 擴增片斷（擴增片斷（bpbp） CPPBCPPB基因基因 5-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3 633 5-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3 633 5-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3 5-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3 外膜蛋白外膜蛋白5-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3 494 5-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3 494 5-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3 5-TTTTC

42、ACATCTACGCGGCGG-3 5-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3 5-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3 181181842.LCR（ Ligase chain reaction ） 連接酶鏈反應連接酶鏈反應(Ligase chain reaction，LCR)，是一種新的，是一種新的DNA體外擴增和檢測技術，體外擴增和檢測技術，主要用于點突變的研究及靶基因的擴增主要用于點突變的研究及靶基因的擴增. 85 原理：在原理：在PCR反應體系中加入二條引物，加反應體系中加入二條引物，加熱熱 (9495)使使DNA變性，雙鏈打開，然后變性，雙鏈打開，然后降溫退火降溫退火(

43、65)，引物與模板，引物與模板DNA結合并留結合并留下一缺口，如果引物與模板完全互補，下一缺口，如果引物與模板完全互補，DNA連接酶即連接封閉缺口，連接酶即連接封閉缺口， PCR反應接著進行，反應接著進行，擴增出大量的目標擴增出大量的目標DNA.若有點突變，引物不若有點突變，引物不能與模板精確結合，缺口附近核苷酸的空間能與模板精確結合，缺口附近核苷酸的空間結構發生變化，連接酶不能封閉缺口，結構發生變化，連接酶不能封閉缺口， PCR反應不能進行，無擴增產物生成，據此可判反應不能進行，無擴增產物生成，據此可判斷模板斷模板DNA中有無突變中有無突變.8687（三）臨床意義（三）臨床意義 1.分子診斷

44、技術具有靈敏性高、快速、特異性分子診斷技術具有靈敏性高、快速、特異性好的優點，可檢測極微量的淋球菌。好的優點，可檢測極微量的淋球菌。 2.應用于以下幾方面：應用于以下幾方面： 對菌株進行分型和耐藥性分析。對菌株進行分型和耐藥性分析。 抗生素治療效果的觀察?？股刂委熜Ч挠^察。 進行流行病學分析。進行流行病學分析。 對疑似病例的診斷和鑒別診斷。對疑似病例的診斷和鑒別診斷。88 第四節第四節 衣原體的基因檢測衣原體的基因檢測 衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原核生物。核生物。 沙眼衣

45、原體是一種在人體內長期生存并又沙眼衣原體是一種在人體內長期生存并又廣泛傳播的病原體，常導致人泌尿生殖道疾廣泛傳播的病原體，常導致人泌尿生殖道疾病及眼病，有病及眼病，有15種血清型。種血清型。89一、基因組一、基因組 沙眼衣原體（血清型沙眼衣原體（血清型D）基因組大小）基因組大小1042Kbp，GC含量為含量為41.3%，另有一個，另有一個7493bp的質粒，整個基因組有的質粒，整個基因組有894個蛋白編個蛋白編碼基因，其中碼基因，其中604個個(68%)編碼蛋白的功能編碼蛋白的功能已明確，已明確，35個個(4%)編碼基因在編碼基因在GenBank收收錄的其他細菌中有同源序列，但功能不清，錄的其他細菌中有同源序列，但功能不清，剩下的剩下的255個個(28%)在在GenBank中沒有檢索中沒有檢索到同源序列。到同源序列。90二、分子診斷二、分子診斷 1. PCR 擴增靶序列主要有外膜蛋白擴增靶序列主